淡紫灰链霉菌s3-5及其在防治玉米灰斑病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种淡紫灰链霉菌 )S3-5及其在防治玉米灰斑病中的应用。
【背景技术】
[0002] 玉米灰斑病是由玉蜀黍尾孢菌（C 引起的一种病害，是玉米重要病 害之一，其危害严重，分布广泛，难以防治。灰斑病发病快，难于控制，并且一旦发病往往造 成整个种植区颗粒无收，给我国的玉米经济带来了非常大的危害。
[0003]目前对灰斑病的防治主要采取物理与化学方法，如通过综合运用抗病品种，加强 栽培管理，结合防治药剂等技术防治玉米灰斑病，存在一定的局限性，且化学农药对环境造 成污染，难以根除。所以寻找新的环境友好型病害防治措施，"以菌治菌"的微生物生物防治 有望从源头解决玉米会斑病的问题。生物防治能将环境中筛选到的拮抗菌株重新应用到环 境中去，通过竞争或产生各种抗生素和酶类一直病原菌生长，在达到防治病害的同时，对环 境的污染很低。但是目前还未筛选出能应用于玉米灰斑病的微生物菌株，因此筛选出能应 用于玉米灰斑病防治的微生物菌株具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术中采用物理和化学方法防治玉米灰斑病存在的局限性大、 难以根除、化学农药对环境污染严重的问题，探索生物农药的新来源，从感染灰斑病的玉米 植株土壤中分离得到的抑菌效果最好的，可用于玉米灰斑病防治的高效、可产业化生产的 放线菌，该菌株鉴定为淡紫灰链霉菌，命名为淡紫灰链霉菌) S3-5〇
[0005] 为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现。
[0006] 淡紫灰链霉菌S3-5,（以下简称为S3-5菌株)，于2015年08月13日保存于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo. 11236,保存单 位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 本发明的S3-5菌株是从四川双流感染灰斑病的玉米植株土壤中分离得到 的抑菌效果最好的放线菌。通过对峙试验发现S3-5对胶孢炭疽菌（CoWeioiricA?gloeosporioide)、卑殊银J]魯{FusariummoniliformeSheld)、资路魏魯{Alteraria aiteraaie)、玉蜀泰平脐懦抱 、立枯丝核菌（TPAizoctowiasoJawi)、核 盘菌scJeiOiior·)、前链格抱 的 7 株菌都 有抑菌作用。S3-5菌株形态特征、培养特征、生理生化特征结果及16SrDNA同源性序列结果 如下： 1、形态特征： S3-5在燕麦片琼脂培养基（ISP3)上生长，具有典型的链霉菌形态特征。菌落呈圆形， 边缘光滑，菌落表面隆起，湿润，气生菌丝不易挑取。培养3d后开始产生孢子，起初孢子为 白色，随着培养时间的延长逐渐转变为紫色，不产生可溶性色素。S3-5在不同平板上的生长 形态各异。气生菌丝分枝较多，无横隔膜，气生菌丝呈簇状，常在气生菌丝的顶端形成孢子 链，孢子链长直形或弯曲，在有些孢子链的顶端会产生螺旋，孢子呈短杆状或卵圆形，表面 光滑。S3-5在不同培养基上的特征见表1。
[0008]表1 :S3_5菌株在不同培养基上的培养特征
"+++"表示生长良好；"++"表示生长一般；" + "表示生长较差。
[0009] 2、生理生化特征及碳源利用 S3-5可以水解淀粉，在纤维素上不能生长，不能利用纤维素作为碳源，明胶液化作用 强，可使牛奶脉化与凝固，但是作用不明显，不产硫化氢，不产黑色素。碳源利用结果显示， S3-5能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、鼠李糖、肌醇、甘露醇，不能利用果糖和棉子糖。 结果见表2。
[0010] 表2 :链霉菌S3-5的生理生化特征
" + "表示阳性结果，" 一"表示阴性结果。
[0011] 3、16SrDNA同源性序列结果 以菌株S3-5基因组总DNA为模板，采用通用16SrDNA引物进行PCR扩增，得到约1. 3kb的特异性扩增产物，经测序，其16SrDNA系列如SEQUENCELISTING所示，该片段长度为 1385bp，具有典型16SrDNA特征。
[0012] 菌株S3-5的16SrDNA序列与GenBank中已登录的16SrDNA序列同源性比对， 显示菌株S3-5与链霉菌属菌株的16SrDNA相似性达100%。将S3-5定义到放线菌目(Actinomycetales)；lil^ |Μ|Μ@(Streptomycineae)；lil^ |M| (Streptomycetaceae)； 链霉菌属（5'&印如^?尺￡^)。基于163扣嫩基因序列构建了与菌株33-5相近菌种的系 统进化树，对S3-5的系统进化分析中可以得到，S3-5与淡紫灰链霉菌 JaKefloWae)和哥伦比亚链霉菌)的16SrDNA序列相似性 都能达到100%。
[0013] 根据上述的S3-5的形态特征、生理生化特征以及单一碳源的利用、16SrDNA同源 性分析，将S3-5定义为淡紫灰链霉菌（JaKefloWae)。但是S3-5与淡紫灰链 霉菌模式菌株的形态生理生化特性还是存在一定的差异，S3-5的孢子形态更接近于短杆状 而不是圆形。
[0014]S3-5的生长温度范围研究表明，该株菌能在10 °C~40 °C的范围内生长，最适生 长温度为25 °C~30 °C。S3-5的耐盐性能较好，NaCl浓度为2%时还能生长。以上的研究 都证明了在实际应用到玉米的种植过程中时，表明链霉菌S3-5有很好的环境适应，有运用 实际的玉米种植中的潜力。
[0015] 为了更好的实施本发明，本发明的另一个目的是淡紫灰链霉菌S3-5在防治玉米 灰斑病中的应用。
[0016] 所述应用包括利用淡紫灰链霉菌S3-5发酵液防治玉米灰斑病，所述淡紫灰链霉 菌S3-5发酵液是将淡紫灰链霉菌S3-5的孢子悬液接种到PDB液体培养基上培养得到。
[0017] 所述的应用包括利用淡紫灰链霉菌S3-5的抑菌物质防治玉米灰斑病，所述抑菌 物质按下述步骤制备： A、 将淡紫灰链霉菌S3-5的孢子悬液接种到PDB液体培养基上培养，制成淡紫灰链霉菌 S3-5发酵液； B、 取步骤A制备好的淡紫灰链霉菌S3-5发酵液以每个培养基50~300uL的量涂布到 马铃薯蔗糖琼脂培养基上，25~28°C培养7~10d，取出琼脂块，研磨成细小的颗粒后按琼 脂块重量的50~70%添加正丁醇，置于0~4°C下，震荡抽提1~2h后用过滤琼脂，收集滤 液，40~60°C旋转蒸发掉正丁醇，即得抑菌物质，0~4°C保存。抽提时缓慢震荡为佳。
[0018] 所述应用包括利用淡紫灰链霉菌S3-5的种子处理剂防治玉米灰斑病，所述淡紫 灰链霉菌S3-5的种子处理剂包括：80~90%淡紫灰链霉菌S3-5发酵液、10~20%成膜 剂。
[0019] 上述发酵液按下述方法制备：将淡紫灰链霉菌S3-5的孢子悬液接种到PDB液体培 养基上，25~28 °C，80~180rmin-1摇床培养3~10d，即得淡紫灰链霉菌S3-5发酵液， 所述孢子悬液的接种量为PDB液体培养基体积的10~30%。
[0020] 所述孢子悬液按下述方法制备：将淡紫灰链霉菌S3-5在燕麦片琼脂培养基斜面 上生长7~10d，用无菌蒸馏水洗下孢子，制成孢子悬液。
[0021] 其中本发明中的燕麦片琼脂培养基配方为：燕麦20g，琼脂20g，MnCl2*4H20 0· 001g，FeS04 · 7H20 0· 001g，ZnS04 · 7H20 0· 001g，蒸馏水 1 000ml，pH7· 2,121Γ高 压蒸汽灭菌20min。
[0022] PDB液体培养基配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，自然 pH。马铃薯煮沸半小时后，过滤，补足1 000mL水，121 °C高压蒸汽灭菌20min。
[0023] 马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA)配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自然 pH。马铃薯加适量自来水煮沸半小时后，八层纱布过滤，补足1 000ml水，121 °C高压蒸汽 灭菌20min。
[0024] 本发明所述的种子处理剂的处理方法为用所述种子处理剂拌种，所述种子处理剂 与种子的比例为1:50~1 :100。
[0025] 所述种子处理剂中的成膜剂为海藻酸钠，壳聚糖中的任意一种。
[0026] 有益效果： 本发明为解决现有技术中采用物理和化学方法防治玉米灰斑病存在的局限性大、难以 根除、化学农药对环境污染严重的问题，探索生物农药的新来源，从感染灰斑病的玉米植株 土壤中分离得到的抑菌效果最好的，可用于玉米灰斑病防治的高效、可产业化生产的淡紫 灰链霉菌S3-5,五毒、无污染，绿色环保。
[0027] 本发明将淡紫灰链霉菌S3-5应用于玉米灰斑病防治，特别是采用淡紫灰链霉菌 S3-5的发酵液、抑菌物质以及采用其制备的种子处理防治玉米灰斑病防治制备方法简单， 且防效高、使用方法简单。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明淡紫灰链霉菌S3-5菌落对峙实验中S3-5对玉蜀黍尾孢菌 zeae的抑菌能力图； 图2为淡紫灰链霉菌S3-5对胶孢炭疽菌病原菌的体外抑菌能力图； 图3为淡紫灰链霉菌S3-5对链格孢菌病原菌的体外抑菌能力图； 图4为淡紫灰链霉菌S3-5对玉蜀黍平脐蠕孢病原菌的体外抑菌能力图； 图5为淡紫灰链霉菌S3-5对立枯丝核菌病原菌的体外抑菌能力图； 图6为淡紫灰链霉菌S3-5对核盘菌病原菌的体外抑菌能力图； 图7为淡紫灰链霉菌S3-5对茄链格孢病原菌的体外抑菌能力图； 图8为淡紫灰链霉菌S3-5抑菌物质对玉蜀黍尾孢菌的抑制作用图； 图9为图8的背面图； 图10为蛋白酶K对淡紫灰链霉菌S3-5抑菌物质稳定性的影响图； 图11为基于16SrDNA基因序列构建的与淡紫灰链霉菌S3-5相近菌种的系统进化树。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例详细说明本发明。
[0030] 本发明以下实施例中培养基配方为： 燕麦片琼脂培养基配方为：燕麦20g，琼脂20g，MnCl2 · 4H20 0. 001g，FeS04 · 7H20 0.001g，ZnS04.7H20 0.001g，蒸馏水 1 000ml，pH7.2,121°C高压蒸汽灭菌 20min。
[0031]PDB液体培养基配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，自然 pH。马铃薯煮沸半小时后，过滤，补足1 000mL水，121 °C高压蒸汽灭菌20min。
[0032] 马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自然pH。 马铃薯加适量自来水煮沸半小时后，八层纱布过滤，补足1 〇〇〇ml水，121°C高压蒸汽灭菌 20min〇
[0033] 实施例1 淡紫灰链霉菌S3-5的筛选和鉴定 通过皿内抑菌试验，从初筛得到8株对玉蜀黍尾孢菌有抑制作用的菌株，其中2株为放 线菌，6株为细菌。其中一株编号为S3-5的放线菌抑菌效果最为明显，抑菌圈直径为15mm， 是8株菌中最大的，同时抑菌圈完全透明，说明在其代谢产物渗透的范围内，能够完全抑制 病原菌的菌丝生长，且菌株S