一株灰色链霉菌cccq171及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株灰色链霉菌（Streptomyces?griseochromogenes）CCCQ171及其应用，所述灰色链霉菌CCCQ171其保藏编号为：CGMCC?No.6227，根据产地命名为嘉陵菌。本发明还公开了所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用及其农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂中含有灰色链霉菌CCCQ171，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。所述灰色链霉菌CCCQ171是从烟田土壤中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
【专利说明】—株灰色链霉菌CCCQ171及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物及微生物应用烟草病害防治领域，具体涉及具有烟草病害防治功能的菌株一株灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)及其应用。
【背景技术】
[0002]自然界在长期进化过程中，植物与周围环境微生物之间存在普遍互作现象。有两类有益的植物-微生物共生:一类是有营养功能的，如固氮细菌或菌根真菌(mycorrhizalfungi);一类是有防御功能的，如抑制病原菌的内生菌和附生菌。这两类有益的共生微生物都能提高植物的适应能力。农用化学物质(化肥和农药)和“精耕细作”的栽培方式在农业生产中发挥着重要作用。在这种栽培方式下，栽培作物中植物一微生物这一平衡体系被打破，缺乏有益的植物-微生物共生，使得作物生产高度依赖于化肥和农药。而化肥农药的频繁使用造成了全球环境的污染，并且污染物最终通过食物链进入人体。因此外源应用有益微生物，重建生态友好的、有益的植物-微生物共生体受到人们的极大关注，并显示了应用这种微生物制剂进行生物防治的潜力。
[0003]烟草病害的综合防治一直是烟叶生产中的重要环节，长期以来化学防治在烟草病害防治策略中占据非常重要的地位。烟草生产上化学农药的大量和长期连续使用以及使用技术的不合理，使得烟草根黑腐病菌产生抗药性，且不同来源的根黑腐病原菌株的抗药性也存在着差异。耐药性菌株的出现不仅增加防治病害的成本，而且加重使用农药对环境的污染，生态系统的破坏，同时也直接影响烟叶品质。在克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势，利用放线菌的次生 代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点已成为无公害绿色农药的主体和未来农药的发展方向。因此，大力开展生防微生物的生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义 。
【发明内容】
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一株灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes) CCCQl71 及其应用。
[0005]一株灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes) CCCQ171,其保藏编号为:CGMCC N0.6227，保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日为:2012年6月15日。
[0006]所述灰色链霉菌CCCQ171的16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
[0007]所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用。
[0008]如上所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
[0009]如上所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
[0010]一种农用微生物菌剂，含有灰色链霉菌CCCQ171。
[0011]如上所述的农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
[0012]如上所述的农用微生物菌剂，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
[0013]从烟株根际土壤中分离获得的灰色链霉菌CCCQ171，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其本身对烟草根黑腐病病菌等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对烟草根黑腐病有很好的防控效果。根据菌株菌落培养性状、形态特征和生理生化性状及16SrDNA序列比对分析，确定CCCQ171菌株为灰色链霉菌，根据产地命名为嘉陵菌。因为该菌株是从烟田土壤中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例2中CCCQ171菌株对烟草根黑腐病病菌的平板拮抗效果图。
[0015]图2为本发明实施例3中CCCQ171菌株对烟草根黑腐病的温室控病效果图。
[0016]图3为本发明实 施例3中CCCQ171菌株对烟草根黑腐病病菌菌丝的直接抑制效果图。
【具体实施方式】
[0017]为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述。
[0018]如无特殊说明，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作，试剂、菌种等均为市售产品。
[0019]实施例1CCCQ171菌株的筛选与鉴定
[0020]从重庆烟田土壤中分离获得的多个菌株经初筛和复筛后得到有抑菌活性的放线菌17株。初筛采用平板对峙法，复筛采用氯仿熏蒸法。最后经过控病防效试验确定对烟草根黑腐病有较好防治作用的为本发明灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)CCCQl71 菌株。
[0021]1.1菌落特征观察
[0022]用酵母精麦芽糖琼脂培养基(ISP-2)、燕麦粉琼脂培养基(ISP-3)、无机盐淀粉琼脂培养基(ISP-4)、甘油天门冬素琼脂培养基(ISP-5)以及马铃薯浸汁培养基、查氏(Czapck)培养基和改良高氏I号培养基制成固体平板培养基。将CCCQ171菌株划线接种于以上7种培养基平板上，28°C恒温培养7-14d，待其菌丝生长稳定后，用解剖镜分别观察单菌落形态、气生菌丝、基内菌丝、孢子丝颜色。
[0023]在不同培养基中CCCQ171菌落形态分别为:
[0024]ISP-2培养基:菌落圆形，中间有褶皱凸起，菌落边缘有晕圈，气生菌丝白色，短绒毛状，孢子丝灰白色，基内菌丝深褐色。
[0025]ISP-3培养基:菌落圆形，边缘菌丝呈短绒毛状，气生菌丝絮状或粉状，先白色后变灰，孢子丝灰色，基内菌丝绛褐色，产生色素。[0026]ISP-4培养基:菌落边缘不规则，略圆形，气生菌丝白色长绒毛状，孢子丝白色，基内菌丝淡黄色，不产色素。
[0027]ISP-5培养基:菌落圆形，边缘菌丝呈放射状，稀疏，气生菌丝灰色长绒毛状，孢子丝灰褐色，基内菌丝从淡黄色到褐黄色，产生色素。
[0028]马铃薯浸汁培养基:菌落中间凸起，边缘有晕圈，气生菌丝白色长绒毛状，孢子丝灰色，基内菌丝从绛紫色到灰色，略产淡褐色色素。
[0029]Czapck培养基:菌落边缘呈放射状，气生菌丝白色长绒毛状，边缘稀疏，中间孢子丝呈絮状，灰色，基内菌丝无色，不产色素。
[0030]改良高氏I号培养基:菌落较大，呈圆形，中间凸起，气生菌丝白色，孢子丝灰白色，基内菌丝绛黄色至深褐色，产生色素。
[0031]L 2菌丝体与孢子特征观察
[0032]采用插片法观察CCCQ171菌株的菌丝形态以及孢子特征。取CCCQ171菌株菌悬液涂布于改良高氏I号培养基上，用镊子夹取已灭菌的盖玻片，以大约45°斜插入培养基内，每平板插4-5片。将插片后的平板倒置于28°C培养，3-5天后用镊子小心取出盖玻片，然后将有菌的一面盖在载玻片上，直接用显微镜观察CCCQ171菌株的气生菌丝、孢子链及孢子的着生情况。CCCQ171菌株的菌丝体与孢子特征:孢子链长而直，成簇，有少数孢子链螺旋状，孢子近球形。由此从形态上初步确定CCCQ171菌株的分类属于放线菌，链霉菌科链霉菌属。
[0033]1.3分子生物学鉴定
[0034]通过提取CCCQ171菌株基因组DNA和16S rDNA PCR扩增，CCCQ171菌株扩增出的16S rDNA片段长度为1487bp,序列如SEQ ID N0.1所示，与链霉菌属(Streptomyces sp.)在遗传上相近。
[0035]灰色链霉菌CCCQ171是首次发现并鉴定的一个新菌株，结合分子生物学鉴定、培养特性、形态特征、革兰氏染色及生理生化试验结果，将CCCQ171菌株确定为灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes),根据产地命名为嘉陵菌。该菌种的活体纯培养已于2012年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCCN0.6227，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0036]实施例2CCCQ171菌株抑菌谱试验
[0037]采用平板对峙法，取不同病菌菌株进行活化，用灭菌打孔器(直径6mm)在菌落边缘区域打孔制成菌片，转接至PDA平板中央，28°C培养48h，待其定殖后，在距离中心30mm处两侧接入CCCQ171菌株，每处理重复3次。28°C恒温培养7d，测量抑菌带宽，测量病菌的菌落直径，计算抑菌率。CCCQ171菌株对烟草病菌的拮抗效果如表1所示。
[0038]表1CCCQl71菌株抗菌谱筛选
【权利要求】
1.一株灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)CCCQ171,其特征在于，其保藏编号为:CGMCC N0.6227。
2.根据权利要求1所述的灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes) CCCQ171,其特征在于，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
3.权利要求1或2所述的灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，其特征在于，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
5.根据权利要求4所述的灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，其特征在于，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
6.一种农用微生物菌剂，其特征在于，所述农用微生物菌剂中含有权利要求1或2所述的菌株。
7.根据权利要求6所述的农用微生物菌剂，其特征在于，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
8.根据权利要求6所述的农用微生物菌剂，其特征在于，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。`
【文档编号】C12N1/20GK103695350SQ201310699082
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】王泊理, 马冠华, 温好菊, 赵勇 申请人:肇庆市真格生物科技有限公司