人工诱导的mle转座子试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人工诱导Mariner-LikeElement(MLE)转座子转座的试剂盒及其在植物基因突变中的应用。本发明的MLE转座子，转座酶由可诱导启动子调控，人为调节转座酶表达，控制转座子跳跃和再跳跃，一方面解决了突变稳定性问题，回复突变也成为可控，可以在植物生长发育的任何时期，对植物的不同组织器官进行有目的的诱导转座突变，真正实现了对诱变在时空量上的全面调控。另外，利用绿色荧光蛋白基因来报告MLE转座子的转座情况，可以简便、有效的对转座发生的植株进行筛选和转座子插入位点进行跟踪。
【专利说明】人工诱导的MLE转座子试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体而言，涉及一种人工诱导的Mariner-LikeElement (MLE)转座子试剂盒及其在植物基因突变中的应用。
【背景技术】
[0002]随着新技术新方法的不断发展，分析鉴定基因功能的方法越来越多，大规模研究基因功能主要依赖于构建突变体库，但最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因功能。因此突变群体的构建是功能基因组学的基础。随着农杆菌介导的植物转基因技术的不断完善，通过创造大量的T-DNA独立转化子来建立T-DNA突变体库的方法已成为快速构建插入突变体库的主要方法。T-DNA插入突变具有插入稳定、操作简单，但是易产生直接的串联，反向重复和在边界产生缺失，影响随后的分子分析。
[0003]转座子是指在基因组上能从同一条染色体的一个位置转移到另一个位置或者从一条染色体转移到另一条染色体上的一段DNA序列，具有分布广泛、拷贝数高、插入位点专一、产生突变稳定、不受植物种类差异的影响、异源转座率高、组织培养诱导激活等优势。可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposontagging)。其原理是利用植物转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因组中获得完整的基因。
[0004]以转座子作标签分离基因有以下优点:(1)转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复。(2)由于转座子总是沿其邻近的位点转座，因此只要转座子在染色体上定位后，就很容易确定与其连锁的突变基因的相对位置。(3)由于转座子的不断跳跃，一旦把转座子导入目标植物，通过自交、杂交、回交等手段便可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体。(4)把转座子导入异源植物`不受转化条件的限制。目前利用转座子标签法成功克隆植物基因目前仅限于Ac/Ds和Spm/dSpm这两类转座子，这两类转座子均存在着转座活性不高，突变效率不理想和优先转座到与之相临近位置的问题，是目前利用转座子构建随机饱和突变体群的主要障碍。因此进一步研究、挖掘新的转座子，改进试剂盒，达到最佳标签条件，是当前转座子标签法研究的主要任务。
[0005]Mariner-Like 转座子(Mariner-LikeElements, MLE)是 DNA 转座兀件中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蚬(Dr ο soph i 1 amaur i s t i ana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。MLE转座子通过DNA的切除/粘贴机制来实现转座。与其它转座子相比较，MLE转座子有以下三个显著特点:(1)结构简单，由两端反向重复序列(TerminallnvertedRepeats, TIRs)和编码转座酶的基因组成，反向重复序列长度一般为10-40bp。转座酶编码序列长度一般为1000-1500bp,由DNA结合域和转座催化域组成。既能催化短至200bp，仅包括TIRs及侧翼序列的DNA片段转座，也能催化携带有目的基因(如抗性基因)，长至6000bpDNA片段的转座，因此MLE转座子既可以开发成基因诱变的突变工具，也可以开发成转运基因的转基因工具。(2)MLE转座子在基因组插入位点接近随机，靶向序列为TA，统计结果表明，MLE转座子80%插入位点位于基因5 ‘端UTR的下游和基因编码序列，这一特点使MLE转座子在应用于基因标签上更优越于其他类型的转座子。(3)异源转座率高，绝大部分MLE转座子转座不依赖于宿主因子，只要有活性转座酶和能被转座酶识别的TIRs存在，就能实现转座，因此从宿主克隆的转座子导入非宿主基因组后，依然能够保持转座活性。因此开发出基于超活性MLE转座子的高效试剂盒，将为大规模构建植物突变体库和研究基因功能提供新的工具，使植物基因的分离和鉴定更加简单易行。查询以往专利，尚未有利用植物MLE转座子构建转座子试剂盒的报道。
【发明内容】
[0006]目前利用转座子标签法成功克隆植物基因目前仅限于Ac/Ds和Spm/dSpm这两类转座子，这两类转座子均存在着转座活性不高，突变效率不理想和优先转座到与之相临近位置的问 题，是目前利用转座子构建随机饱和突变体群的主要障碍。因此进一步研究、挖掘新的转座子，改进试剂盒，达到最佳标签条件，是当前转座子标签法研究的主要任务。
[0007]本发明一方面涉及一种MLE转座子试剂盒，其特征在于包括含有核苷酸序列为SEQIDN0.2的miniPpMLE21的载体以及含有核苷酸序列为SEQIDN0.3的转座酶序列的载体。
[0008]在本发明的一个优选实施方式中，其中含有核苷酸序列为SEQIDN0.2的miniPpMLE21的载体是将miniPpMLE21转座子构建到pBINm-gfp5_ER载体上，获得转座子供体载体 pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21。
[0009]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的含有核苷酸序列为SEQIDN0.3的转座酶序列的载体是转座酶序列构建到PCAMBIA1301载体上。
[0010]本发明另一方面还涉及上述MLE转座子试剂盒在诱变转基因植物中的应用。
[0011]在一个优选实施方式中，所述的应用包括如下步骤:
[0012](1)将miniPpMLE21转座子构建到pBINm-gfp5_ER载体上，获得转座子供体载体pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21，转化拟南芥，通过卡那霉素筛选阳性植株；
[0013](2)转座酶序列(SEQIDN0.3)构建到pCAMBIA1301载体，获得转座酶表达载体pCAMBIA1301-Tp，转化携带有PpMLE21转座子的拟南芥，通过卡那霉素和潮霉素共同筛选阳性植株；
[0014](3)通过提高培养环境的温度，诱导转座酶表达和转座发生。
[0015]本发明的MLE转座子，转座酶由可诱导启动子调控，人为调节转座酶表达，控制转座子跳跃和再跳跃，一方面解决了突变稳定性问题，回复突变也成为可控，可以在植物生长发育的任何时期，对植物的不同组织器官进行有目的的诱导转座突变，真正实现了对诱变在时空量上的全面调控。另外，利用绿色荧光蛋白基因来报告MLE转座子的转座情况，可以简便、有效的对转座发生的植株进行筛选和转座子插入位点进行跟踪。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:绿色荧光指示转座发生，其中a，b，c为不同转基因株系绿色荧光观察。WT为野生型。【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施步骤进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非特别指出，下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook.等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作。
[0018]一、毛竹MLE转座子的获得
[0019]根据MLE转座子两端反向重复序列，利用引物MLE21(引物详情见表1)，从毛竹基因组扩增出转座子PpMLE21的全长序列，序列为SEQIDN0.11。
[0020]二、拟南芥转化载体构建
[0021]1.转座子供体载体 pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21 的构建
[0022](1)用BseRI (识别的序列为GAGGAG (N) 10 )切除毛竹PpMLE21转座子全长序列中转座酶的大部分序列，再用连接酶将PPMLE21转座子两侧的序列重新连上，命名为miniPpMLE21,(序列为 SEQIDN0.2)；
[0023](2) Xbal 酶切 pBINm-gfp5_ER 载体，将 pBINm-gfp5_ER 载体线性化；
[0024](3)通过in-fusion技术将miniPpMLE21转座子插入到pBINm-gfp5_ER载体(商购可得)的Xbal酶切位点，获得重组载体pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21。当miniPpMLE21转座子转座离开，后面的绿色荧光蛋白基因可以正常表达，可通过绿色荧光蛋白基因表达与否方便分析转座情况。
[0025]2.转座酶表达载体pCAMBIA1301_hspTp的构建
[0026](1)将PART7载体上的基因表达单元通过sacl和PstI从载体切下来；同时利用sad和PstI将pCAMBIA1301载体(商购可得)线性化；通过连接酶将来源于PART7载体的基因表达单元插入到PCAMBIA1301载体sacl和PstI两个酶切位点之间获得重组载体pCAMBIA1301-ex ；
[0027](2)利用引物MLE21-TP-5和MLE21-TP-3通过PCR技术将PpMLE21转座酶序列(序列为SEQIDN0.3)两端添加Sma I和BamH I酶切位点，PCR扩增后，用Sma I和BamH I双酶切PCR产物，同时利用Smal和BamHI酶切pCAMBIA1301_ex载体，通过连接酶将PpMLE21转座酶的cDNA序列引入pCAMBIA1301-ex载体Smal和BamHI两个酶切位点间，获得重组载体 pCAMBIA1301-Tp ；
[0028](3)通过PCR技术将大豆热激启动子一Gmhspl7.5C启动子(序列SEQIDN0.4)从大豆的基因组扩增出来(引物为Gmhsp-5和Gmhsp-3)，并引入sacl和ΚρηΙ两个酶切位点，经测序验证后，将Gmhspl7.5C启动子序列和pCAMBIA1301_Tp载体通过sacl和ΚρηΙ双酶切，用Gmhspl7.5C启动子替换pCAMBIA1301_Tp载体转座酶前的35S启动子，获得重组载体pCAMBIA1301-hspTp。转座酶的表达可以通过环境温度来调控。
[0029]三、拟南芥的转化
[0030]拟南芥种子在8%NaC10乙醇溶液中消毒6_8min，用无水乙醇洗涤待播种种子5次以上，用无棉纸吸干无水乙醇，在超净工作台上吹干，将种子均匀播撒在1/2MS培养基上，4°C沉积3天，然后放在拟南芥栽培室光下正常培养(栽培室条件:温度23°C，湿度60-70%，光强150umol.s-1.m_2)。待一周后长出1对真叶，将拟南芥幼苗移至基质中培养3周左右抽薹开花，去掉主薹，大约一周后，抽出的莲座叶侧枝大量开花，剪掉已经结荚的果荚，准备转化。
[0031]取5mL农杆菌(EHA105)加入100mL含50 μ g/mL利福平(Rif )+50 μ g/mL卡纳青霉素(Kan )液体 YEP (配方:酵母提取物，10g/L ;蛋白胨，10g/L ;NaCl，5g/L)中，28 °C，180rpm,摇菌过夜使其0D600达到L 0-1.2,4000rpm,离心15min，弃上清，加入lOOmL浸润法培养基(l/2MS+5%蔗糖)，并加入表面活性剂Silwet-77，使其终浓度达0.02%。将重悬的农杆菌菌液置于培养皿中，将拟南芥花序完全浸没在溶液中，保持30s-60s。用保鲜膜保湿，向周转柜中加水，暗室培养24h后，光下正常培养。隔5天左右可对已浸染植株再次浸染，提高转化率。种子成熟后适当减少浇水次数，待种荚发黄开裂时收获种子，用于下一代的筛选。
[0032]四、转基因阳性植株筛选和鉴定
[0033]导入转座子供体载体pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21的拟南芥种子播撒到含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基中筛选，抗性植株通过PCR验证(引物为MLE21)，能扩增出1.2kb左右的目的条带为阳性植株
[0034]以上述阳性拟南芥植株为受体，继续转化转座酶表达载体pCAMBIA1301_hspTp，将收获的拟南芥种子播撒到含50mg/L卡那霉素+50mg/L潮霉素的1/2MS培养基中筛选，转基因抗性植株通过PCR验证(引物为MLETP21-5和MLE21TP-3)，能扩增出1.5kb左右的目的条带为阳性植株，该阳性转基因植株命名为双阳性植株。
[0035]五、转座诱导和转座事件的鉴定
[0036]( 1)双阳性植株的转座诱导
[0037]42°C连续热激两次双阳性植株的幼苗，每次2小时可以诱导最高的转座活性。然后放在21°C恢复培养，同时增加 培养环境的湿度，两天后在突光显微镜下观察突光。
[0038](2)绿色荧光观察
[0039]取拟南芥新鲜的叶片，手工撕成0.1-1.0mm薄片，将荧光显微镜的光源波长调到477nm处，观察绿色荧光的位置。有绿色荧光点的细胞表明有转座发生。从图1中可以看出和野生型相比，经过高温诱导后，可看到大量发生转座的细胞(绿色荧光的部分)。这说明，构建的Mariner-LikeElement (MLE)转座子试剂盒可以在人工诱导下转座，并保持较高的转座效率。
[0040]表1引物表
[0041]
【权利要求】
1.一种MLE转座子试剂盒，其特征在于包括含有核苷酸序列为SEQIDN0.2的miniPpMLE21的载体以及含有核苷酸序列为SEQIDN0.3的转座酶序列的载体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中含有核苷酸序列为SEQIDN0.2的miniPpMLE21的载体是将miniPpMLE21转座子构建到pBINm-gfp5_ER载体上，获得转座子供体载体pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21ο
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的含有核苷酸序列为SEQIDN0.3的转座酶序列的载体是转座酶序列构建到PCAMBIA1301载体上。
4.上述MLE转座子试剂盒在诱变转基因植物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，所述的应用包括如下步骤:(1)将miniPpMLE21转座子构建到pBINm-gfp5_ER载体上，获得转座子供体载体pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21，转化拟南芥，通过卡那霉素筛选阳性植株；(2)转座酶序列(SEQIDN0.3)构建到pCAMBIA1301载体，获得转座酶表达载体pCAMBIA1301-Tp，转化携带有PpMLE21转座子的拟南芥，通过卡那霉素和潮霉素共同筛选阳性植株；(3 )通过提高培养环境的温·度，诱导转座酶表达和转座发生。
【文档编号】C12N15/11GK103710342SQ201310698907
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】周明兵, 汤定钦, 杨萍, 郑丽娜 申请人:浙江农林大学