用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记，选择刀鲚逆转座子SINE的多态性位点为目标，依据插入位点的侧翼序列，设计特异性引物，应用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、分子克隆等方法获得SINE插入或缺失位点的DNA片段，用这些特异的DNA片段来识别刀鲚的不同种群。本发明可以快速、准确地确定刀鲚种群，在刀鲚的分子标记辅助育种、鱼苗的人工放流效果评价和种群动态监测等方面具有广泛用途。
【专利说明】用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类的分子生物学【技术领域】，具体地说，是一种用于刀鲚不同生态型 种群识别的分子标记。
【背景技术】
[0002] 鱼类物种的界定涉及两个层次，一是物种水平，二是种群水平。物种识别方法有外 部形态判断法、生化法，以及最近十几年发展的一种分子标记的方法。形态判断法常用于物 种水平的鉴别；种群水平的识别，曾使用生化方法，但该方法较为繁锁，且误判率也较高，现 基本上不再采用，取而代之的是一种分子标记的方法。因为分子标记的稳定性好，现被广泛 地应用于鱼类种群识别、种群遗传结构、遗传作图等理论研究，以及鱼类保护生物学和鱼类 遗传育种等实践领域。
[0003] 目前，基于DNA片段差异作为分子标记的主要有3种：（1)基于PCR的分子标记 技术，如限制性片段长度多态性，随机扩增多态性DNA，基因特异扩增片段长度多态性等； (2)基于重复序列的分子标记，如微卫星DNA和小卫星DNA; (3)基于转座子的插入和缺失 的分子标记，如Tel和SINE。
[0004] SINE ( short interspersed element , SINE )称短散在重复序列，序列长度 一般仅为1〇〇?500 bp，在真核生物基因组中的拷贝数为103~105,散布于生物基因组内。 SINE具有3个结构域：5'端tRNA相关区、tRNA非相关区、3'端尾区。SINE在相关的逆转 座酶的介导下，通过"复制一插入"的机制，其复制子整合到宿主的基因组内。SINE插入到 基因组内后，将会产生稳定的遗传；而且宿主对SINE的插入缺乏删除机制，使得不同种系 基因组的等位点产生SINE的插入或缺失，通过"插入或缺失"性状，可识别不同的种系或种 群。
[0005] 中国专利文献CN103820467A公开了一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离 方法，先分离出牡丹SINE类反转录转座子的部分序列，根据其序列设计引物；以所设计引 物进行PCR反应，得到生物素标记的探针；提取牡丹基因组后进行酶切，得到基因组酶切片 段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后将酶切后的基因组片 段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集；将生物素标记的探针与 所得基因组片段杂交，筛选出目的片段；所得目的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆 及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。目前，针对 鱼类开发的SINE分子标记非常稀少，本发明提供的对于名贵的刀鲚的不 同生态型种群的SINE标记还未见研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于刀鲚不同生态型种群识别 的分子标记。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于刀鲚不同生态型种群识别 的分子标记，所述的分子标记为SINE插入位点的特异引物，所述的特异引物为Locus 18位 点、Locus 40位点或Locus 58位点的引物的一种或者其组合，所述的引物序列分别为： Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0008] 所述的分子标记用于识别刀鲚的不同种群。
[0009] 所述的分子标记进行种群识别的方法，包括以下步骤：运用所述的分子标记通过 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，根据扩增片 段数目、大小的差异性，识别出刀鲚的不同种群。
[0010] 本发明优点在于： 基于SINE位点扩增片段的数目和大小的分子标记技术，可以快速、准确地确定刀鲚种 群。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 附图1是刀鲚的6个不同种群：浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江苏靖江（JJ)， 太湖（TH)，江西鄱阳湖（PY)，湖南洞庭湖（DT)种群，每个种群样本数10尾（1 一 10)，Locus 18 DNA片段的扩增结果。
[0012] 附图2是刀鲚的6个不同种群：浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江苏靖江（JJ)， 太湖（TH)，江西鄱阳湖（PY)，湖南洞庭湖（DT)种群，每个种群样本数10尾（1 一 10)，Locus 40 DNA片段的扩增结果。
[0013] 附图3是刀鲚的6个不同种群：浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江苏靖江（JJ)， 太湖（TH)，江西鄱阳湖（PY)，湖南洞庭湖（DT)种群，每个种群样本数10尾（1 一 10)，Locus 58DNA片段的扩增结果。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 本发明通过选择SINE插入位点的侧翼序列，设计特异引物，利用PCR、分子克隆和 测序等现代分子生物学技术，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统获得的图片，根据凝胶图片上 DNA片段的大小和数目，识别刀鲚不同生态型种群。
[0016] 实施例1 实验材料 刀鲚按照样本来源，分为浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江苏靖江（JJ)，太湖（TH)， 江西鄱阳湖（PY)，湖南洞庭湖（DT) 6个种群，每个种群样本数为10尾。浙江象山港样本来 自水产品市场，采集地不祥，其余样本为随船捕捞。
[0017] 基因组DNA提取 样本基因组DNA的提取，按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒说明 书操作，提取的DNA用紫外分光光度计检测其质量和浓度，-20°C保存备用。
[0018] 位点分离 根据SINE的保守序列设计引物，通过PCR方法获得刀鲚基因组中SINE部分序列，此序 列的5端连接生物素，作为探针，然后与磁珠形成"探针一生物素一磁珠"复合体后，与酶切 的刀鲚基因组DNA文库杂交，捕获文库中包含SINE的DNA片段，克隆和测序，由此得到刀鲚 基因组中SINE插入位点的信息。
[0019] 引物设计 根据SINE插入位点的侧翼序列，用PrimerPremier6. 0软件和Jellyfishl. 4软件，设计 SINE插入位点的特异引物，由上海Sangon生物工程公司合成，PCR对刀鲚不同生态型种群 的DNA扩增后，有3对引物在不同种群中扩增出差异的DNA条带，其序列分别是： Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0020] 扩增和克隆 PCR扩增反应在德国Eppendorf公司生产的Mastercycler? ep gradient热循环仪 上进行，每个扩增反应总体积为20ul，其中模板基因组DNAlOOng，每种dNTP，每种引物各 0· 5ul，TaqDNA聚合酶0· 25U，反应液在94°C预变性 3 min，94°C变性 30sec，60°C退火30sec， 72°C延伸8min，共35个循环，最后在72°C延伸10min。PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳中分 离，用上海Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段，纯化方法参照产品手册进行， 将回收的DNA片段克隆于载体pMD19 - T(TakaRa公司），连接反应及细菌转化按pMD19 - T载体试剂盒说明书进行操作。
[0021] 测序和序列分析 选取阳性克隆菌落，经PCR鉴定后，由上海Sangon公司对阳性克隆进行测序，采用 Blastn软件进行核苷酸序列相似性比较，分析所得克隆序列是否在其他物种中存在同源 性。依据Jellyfish软件分析SINE的插入或缺失。
[0022] 综合运用以上实验方法与技术，扩增刀鲚不同生态型种群中SINE插入或缺失位 点的DNA片段，下面将结合附图，进一步详述其扩增结果在刀鲚种群识别上的应用。
[0023] 从图1可知，XS、CM、JJ、TH的种群中，样本能扩增出1条大小分别约为450 bp的 条带；PY、DT的种群中，样本能扩增出450,200bp的条带，仅在PY5和DT6、DT7样本中不能 扩增200 bp的条带。Locus 18位点的200bp的条带，用于识别PY和DT种群样本的准确率 85% (17/20)。
[0024] 从图2可知，XS、CM、JJ、TH的种群的样本，部分样本能扩增出450、250 bp的2条 带；PY、DT群体样本都能扩增出1条大约450bp的条带。Locus 40位点的250bp的条带，用 于识别CM、JJ、TH种群样本的准确率73% (22/30)，从XS的群体中误判率为20% (2/10)，可 把CM、JJ、TH种群与XS、PY、DT群体相区分。
[0025] 从图3可知，XS、CM、JJ、TH的群体样本都能扩增出1条大小约为400 bp的条带； PY、DT的群体样本能扩增出1条约为300bp的条带，仅PY9扩增出400bp的条带。Locus 58 位点的300bp的条带，用于识别PY和DT种群样本的准确率95% (19/20)，可把PY、DT种群 与XS、CM、JJ、TH群体相区分。
[0026] 综合使用上述3个位点的SINE分子标记，可快速、准确地识别出刀鲚的鄱阳湖和 洞庭湖的种群。
[0027] 实施例2 实验方法 SINE插入位点的特异引物，其序列为： Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0028] 通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片 段，根据扩增片段数目、大小的差异性，识别出刀鲚的不同种群。
[0029] 实施例3 实验方法 SINE插入位点的特异引物，其序列为： Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO. 2所示。
[0030] 通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片 段，分析Locus 18位点的测序结果，能够扩增出1条大小约为450bp的条带但不能扩增出 200bp的条带的样本为象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚，能扩增出450、200bp的条带的样 本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
[0031] 实施例4 实验方法 SINE插入位点的特异引物，其序列为： Locus 40位点的上游引物如SEQ ID N0. 3所示， Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO. 4所示。
[0032] 通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片 段，分析Locus 40位点的测序结果，能扩增出450bp、250bp的2条带的样本为崇明、靖江或 太湖的刀鲚，能扩增出1条约为450bp的条带的样本为象山港、鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
[0033] 实施例5 实验方法 SINE插入位点的特异引物，其序列为： Locus 58位点的上游引物如SEQ ID N0. 5所示， Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0034] 通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片 段，分析Locus 58位点的测序结果，能够扩增出1条大小分别约为400 bp的条带的样本为 象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚，能扩增出1条约为300bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭 湖的刀鲚。
[0035] 实施例6 实验方法 SINE插入位点的特异引物，其序列为： Locus 40位点的上游引物如SEQ ID N0. 3所示， Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0036] 通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片 段，分析Locus 40和Locus 58位点的测序结果：Locus 40位点能扩增出450bp、250bp的 2条带，Locus 58位点能够扩增出1条大小分别约为400 bp的条带的样本为崇明、靖江或 太湖的刀鲚；Locus 40位点能扩增出1条约为450bp的条带，Locus 58位点能够扩增出1 条大小分别约为400 bp的条带的样本为象山港的刀鲚；Locus 40位点能扩增出1条约为 450bp的条带，Locus 58位点能够扩增出1条大小分别约为300 bp的条带的样本为鄱阳湖 或洞庭湖的刀鲚。
[0037] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 SEQUENCE LISTING 〈110>上海海洋大学 〈120>用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记 <130> / <160> 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 ggcatggttg acaatgtgct ctg 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 acctgctctt ccttgatttc cactc 25 <210> 3 <211> 21 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 3 ccatcggaga gcacgcaact t 21 <210> 4 <211> 20 〈212> DNA 〈213>人工序列 <400> 4 acctgccgcc ttccaactga 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 5 ccaccaggtc tgtcagtgtt gtt 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 6 gtgccaggat ggaggatgtc att 23
【权利要求】
1. 一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记，其特征在于，所述的分子标记为 SINE插入位点的特异引物，所述的特异引物为Locus 18位点、Locus 40位点或Locus 58 位点的引物的一种或者其组合，所述的引物序列分别为： Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
2. 根据权利要求1所述的分子标记的用途，其特征在于，所述的分子标记用于识别刀 鲚的不同种群。
3. 根据权利要求1所述的分子标记进行种群识别的方法，其特征在于，包括以下步骤： 运用所述的分子标记通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异 性的DNA片段，根据扩增片段数目、大小的差异性，识别出刀鲚的不同种群。
【文档编号】C12N15/11GK104099423SQ201410355166
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】刘 东, 朱国利, 唐文乔 申请人:上海海洋大学