一种鱼类胃肠内含物快速定量分析方法及其应用与流程

本发明涉及生物营养生态学研究技术领域，更具体地，涉及一种鱼类胃肠内含物快速定量分析方法及其应用。

背景技术：

现代鱼类生态学中鱼类食性研究的标准方法是胃肠内含物分析法，利用此方法一方面可以估测鱼类群落的营养结构以及每种鱼类在群落中的营养水平，进一步研究生态系统中食物链和食物网上的物质循环，另一方面是研究鱼类种群消费食物量，即生物学能量收支问题。

现有研究方法中，鱼类胃肠内含物的分析可通过某类食源的出现频率、个体数、体积以及质量百分比来确定。

出现频率即含有某一食物成分的胃数占总胃数(非空胃数)的百分比。如果食物种类容易确定，则该方法迅速、简便。但它仅能粗略地反映鱼类食性的一个侧面，即鱼类对某种食物的喜好程度，不能明确表达某一类食物成分占胃内含物数量和体积的比例。

个体数组成即胃内含物中某一类食物成分的个体数占胃含物中食物组成总个数的百分比，此方法适用于检测食源个体规格相近的鱼类，如以浮游生物为食鱼类，在检测食性较杂的鱼类时，个体数法可能夸大小型生物食源的重要性，且因小型生物消化得迅速，在检测中难以准确计数。此外，由于食物在肠道中被消化分析，单个食物个体可能被多次计数，如环节动物门食源可断裂成多个相似个体，从而扩大了某类生物个体的食物重要性。

重量和体积百分比是指某一类食物的更正重量和体积占胃肠内含物总重量和总体积的百分比，重量法在食物重要性研究中易过高估计单个大个体食物成分的重要性，在分析幼稚鱼和小型杂食性鱼类时对微型生物难以称量。

体积法可采用分级测量器把食物成分从内含物中分离出来并计算体积，对于难以直接计算体积的小型食物个体，可计算数个食物个体的总体积，然后计算个体的平均体积，尽管体积百分比法能较客观地反应食物组成，但在分析含有外形结构复杂的甲壳类或有坚硬外壳的软体动物食物团时，体积法操作复杂且大小合适的体积测量器也难以制作。

现有鱼类胃内含物的分析方法，并不具有合理的通用性，都不能满足综合检测水生态系统中不同鱼类食物来源组成的问题，因此，急需一种适用面广、操作简单的鱼类胃肠内含物快速定量分析方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对现有鱼类胃内含物的分析方法不能满足统一分析不同水域鱼类食物来源组成的技术缺陷，提供一种鱼类胃肠内含物快速定量分析方法。

本发明要解决的另一技术问题是提供所述方法在鱼类生态学中鱼类食性研究方面的应用。应用本发明方法，可对不同鱼种的食性组成进行定量分析，且便于对不同鱼种间食物来源差异进行比较，该方法可用于食物网构建和生态系统能量流动等研究。

为达到上述目的，本发明提供一种河流鱼类胃肠内含物快速定量分析方法，包括以下步骤：

s1.解剖分离鱼类胃肠内含物，对其各组分进行分类鉴定，判断胃肠中是否存在可辩大块食物残体或难辨的微型食源；

如果不存在可辩大块食物残体，直接进入步骤s3和s4；

如果不存在难辨的微型食源，仅进行步骤s2的检测；

如果可辩大块食物残体和难辨的微型食源共存，收集剩余难辨的微型食源作为混合食团，进行步骤s2至s4的检测；

s2.称取大块食物残体中各组分的湿重，将收集的混合食团作为单一组分进行称重，以重量百分比对内含物中各主要食源组分进行初步划分；

s3.取部分混合食团置于光学显微镜下进行分类鉴定，测算计数板中各微型食源体积，以体积百分比对混合食团中的微型食源组分进行划分；

s4.根据所得混合食团重量百分比，还原各微型食源所占内含物总量的实际比例，使全部食源组分在量纲上统一，定量鱼类胃肠内含物。

优选地，步骤s1是从腹部剖开鱼类样本取出胃肠组织，用解剖剪剪开胃肠壁，用解剖刀和镊子刮取胃肠中内含物，保留有效(饱满度>20％)内含物样本，置于玻璃皿中，在体式解剖镜下分离内含物中可直接挑拣的大块食物残体1～i，收集剩余由无法辨识的微型食源组成的混合食团j；

步骤s1和步骤s2是在体式解剖镜下对挑拣出的大块食物残体1～i进体行分类鉴定，并对各组分进行称重w1～wi(湿重g，下同)，剩余无法辨识的混合食团j作为单一组分称重w混合，通过计算w1～wi和w混合占内含物总重w总的百分比，得已鉴定出的食源组分1～i和未识别混合食团j的相对重量值，分别计为rg1～rgi和rg混合(％)，计算方法如下：

w总(g)＝w1+w2…+wi+w混合

步骤s3是取混合食团j中的一部分置于20mm×20mm(长×宽)玻璃计数板表面，璃计数板面平均分成10×10个计数格(4mm²/格)，用水(蒸馏水)进行稀释并搅匀，按压盖玻片使微型食源产生形变，移置光学显微镜下，先在10×10倍镜下全片计数大于50μm的微型食源，再于10×40倍镜下全片计数小于50μm的微型食源，对观察到的混合食团j中的微型食源1～m进行分类鉴定；

步骤s4是在显微镜下根据各类微型食源的近似几何形状(矩形、三角形、梯形、椭圆)估算其表面积s(μm²)，由于受盖玻片紧压变形，各微型食源高度h(μm)可视为一致，在计算体积时可直接约分，所得混合食团j中微型食源j1～jm的近似表面积为sj1～sjm(μm²)，体积为vj1～vjm(μm³)，进一步计算混合食团中各微型食源所占内含物总量的体积百分比rvj1～rvjm(％)：

vim(μm³)＝sxh

本发明方法中，所述大块食物残体包括：各种鱼类、甲壳类游泳动物、软体动物、水生和陆生幼虫、近海多毛环节动物、水生植物碎片和/或沉积腐殖质碎块。

优选地，本发明所述技术方案步骤s1和步骤s2中，在体式解剖镜下可直接挑拣的大块食物残体包括：各种鱼类，虾、蟹等甲壳类游泳动物，软体动物的肌肉和碎壳，水生昆虫幼虫和沿岸带陆生昆虫，沙蚕、海稚虫和缨鳃虫科等近海多毛环节动物、水生植物碎片、沉积腐殖质碎块；

优选地，本发明所述技术方案步骤s3和步骤s4，在光学显微镜下分类鉴定的微型食物残体包括：浮游植物(蓝细菌、绿藻门和浮游硅藻为主)、浮游动物(枝脚类、桡足类、轮虫、原生动物)、着生藻类(附生硅藻和丝状绿藻为主)、有机碎屑(降解植物、真菌、微生物膜)、悬浮颗粒物、底泥沉积物。

优选地，本发明所述技术方案在步骤s1至s4之外，还涉及还原残缺食源重量至被捕食前完整个体重量的步骤和方法，可更好地消除各食源因消化过程产生的误差，所述方法包括以下：1)以文献报道或相同水域采集的完整个体平均重量，作为内含物中此类食源残缺个体的更正重量；2)内含物中某类食源个体数较多(如双翅目、蜉蝣目、十足目、端足目等)，可筛选保留相对完整的个体的平均重量作为更正重量；3)部分食物残体(体长<3mm，如寡毛类、摇蚊幼虫、小型甲壳动物等)因个体过小难以称量，可先估算其近似几何形状，在假定比重为1的情况下，根据“体长-体重”关系估算其重量；4)部分食物残体已形态难辨，可对其残留(如水生昆虫、甲壳类和多毛类)头壳、跗肢、围眶骨、刚毛、吻、疣足等器官的长度进行测量，根据“器官长-体长-体积/体重”经验公式，估算该食源被捕食前重量；5)收集内含物中难消化的软体动物外壳碎片，根据软体动物外壳和肌肉间的重量比，还原其被捕食前重量。

本发明的有益效果在于：

(1)降低了传统内含物检测方法在食物数量、体积、重量、出现频率统计过程中的复杂程度，简化了分类鉴定和定量分析步骤。

(2)克服了传统的单个胃肠内含物分析方法在分析不同食性鱼类时的特殊性，可以对不同摄食形态鱼类进行统一分析，检测结果具有广泛的可比性。

(3)采用了消除个体重量误差的方法，将已消化食物残体还原至被捕食前的完整个体重量，使定量分析结果更加准确。

(4)本发明可快速地对鱼类的胃肠内含物进行分析，为水生态系统中鱼类食物网的研究提供了便捷的食性定量分析方法。

附图说明

图1本发明方法步骤示意图。

图2斑鳢胃肠内含物中部分食源组分鉴定。

图3马口鱼胃肠内含物中部分食源组分鉴定。

图4鲤胃肠内含物中部分食源组分鉴定。

图5鳙胃肠内含物中部分食源组分鉴定。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。本发明方法步骤示意图见图1所示。

实施例1对肉食性鱼类斑鳢的食性定量分析

本实施例采用的斑鳢样本于广东省新丰江水库随机采集。

s1.从腹部剖开取出胃肠，用解剖剪剪开胃肠壁，用解剖刀和镊子刮取胃肠中内含物，保留8个有效(饱满度>20％)内含物样本，置于玻璃皿中，在体式解剖镜下对样本中的大块食物残体进行分离。

s2.对体式解剖镜下对挑拣出的i个大块食物残体进行分类鉴定，根据食源的主要形态特征和分类器官，本实施例共鉴定出鱼类4种：子陵吻鰕虎鱼、宽鳍鱲、条纹二须鲃、泥鳅；甲壳类1种：日本沼虾；水生昆虫幼虫2科：春蜓科和大蜓科，食源组成如图2所示。从食物完整性上判断，鱼和虾的被捕食时间较短，个体相对完整，可直接称重，而蜻蜓目幼虫肢体破碎，唯有难消化的头壳(包含口器)和跗肢还较为完整，根据春蜓科和大蜓科幼虫完整个体的“跗肢长-体重”关系，以内含物中残留的跗肢推算其被捕食前的个体重量。此外，因肉食性鱼类不直接摄食微型食源，且在光学显微镜下对剩余胃液包裹的粘稠状混合食团镜检未发现任何食物迹象，故忽略混合食团所占比例。以样本个体为单位，在感量为0.0001g的电子天平上称取已鉴定出的各食源湿重w1～w6(g)，计算其相对重量百分比rg1～rg6。

计算方法如下：

w总(g)＝w1+w2…+wi+w混合

斑鳢胃肠内含物定量分析结果如表1所示，其主要食物类型依次为：鱼75.53％、虾19.71％、蜻蜓幼虫4.75％；按照各食源组分所占比例排序依次为：子陵吻鰕虎鱼31.91％、条纹二须鲃20.99％、日本沼虾19.71％、宽鳍鱲14.87％、泥鳅7.76％、春蜓科2.42％、大蜓科2.33％。

表1斑鳢胃肠内含物中各食源组分的定量分析结果

实施例2对昆虫食性鱼类马口鱼的食性定量分析

本实施例马口鱼样本随机采集于广东省流溪河，胃肠解剖及内含物取样过程及操作步骤、计算方法同实施例1。共鉴定出水生昆虫幼虫6科：纹石蛾科、多距石蛾科、四节蜉科、扁蜉科、春蜓科、划蝽科；陆生昆虫2种：草蜢、蚂蚁；鱼类1种：宽鳍鱲(幼鱼)。与肉食性鱼类胃中大个体的鱼、虾食源不同，昆虫食性鱼类胃肠内含物中多以水生昆虫幼虫为主，食源个体虽小，但数量多，除春蜓科残体的计算方法同实施例1外，其他小个体昆虫的重量计算，取内含物中保留相对完整的昆虫个体，以这些个体的体重平均值代表被捕食前的完整个体重量。此外，昆虫食性鱼类也较少直接摄食微型食源，光学显微镜下镜检查发现的部分附生藻和植物碎屑为捕食昆虫时摄入，故与肉食性鱼类一样，忽略胃肠中残留混合食团所占比例。马口鱼食源组成如图3所示，胃肠内含物定量分析结果如表2所示，其主要食物类型依次为：水生昆虫73.60％、陆生昆虫19.56％、鱼6.83％；按照各食源组分所占比例排序依次为：毛翅目幼虫31.47％(纹石蛾科16.60％、多距石蛾科14.87％)、蜉蝣目幼虫25.52％(四节蜉科17.58％、扁蜉科7.94％)、蜻蜓目幼虫14.39％(春蜓科12.45％、前原蟌科1.94)、草蜢13.92％、宽鳍鱲6.83％、蚂蚁5.65％、半翅目幼虫(划蝽科2.23％)。

表2马口鱼胃肠内含物中各食源组分的定量分析

实施例3对杂食性鱼类鲤的食性定量分析

本实施例的鲤样本随机采集于广东省惠州西湖，胃肠解剖及内含物取样过程及操作步骤、计算方法同实施例1。共鉴定出软体动物2种：淡水壳菜、河蚬，水生植物1种：黑藻。与肉食性和昆虫食性鱼类的直接吞食方式不同，鲤先咬碎水生植物和带有外壳的软体动物后吞食，故内含物中只残留水生植物和软体动物碎片，无完整个体，食源组成如图3所示。水生植物的茎叶残体可在体式解剖镜下挑拣后聚集在一起称重；软体动物外壳碎片难消化且易挑拣，但由于其肌肉组织易被胃液分解，故个体重量误差变大。可采取说明书中所述方法，根据软体动物外壳和肌肉部分的湿重比例(淡水壳菜的壳:肉≈0.711，河蚬的壳:肉≈2.419)，将收集到的淡水壳菜和河蚬的外壳碎片分别统一称重，然后根据壳肉比推算二者被捕食前的完整个体重量。

在实施例1所述的步骤s1和步骤s2以外，本实施例还包括以下步骤：

s3.取混合食团j中的一部分置于20mm×20mm(长×宽)玻璃计数板表面，璃计数板面平均分成10×10个计数格(4mm²/格)，用水(蒸馏水)进行稀释并搅匀，按压盖玻片使微型食源产生形变，移置光学显微镜下，先在10×10倍镜下全片计数大于50μm的微型食源，再于10×40倍镜下全片计数小于50μm的微型食源，对观察到的混合食团j中的微型食源1～m进行分类鉴定；

鲤除咬食软体动物和水生植物外，还刮食基质表面的附着生物和沉积碎屑，如图4中所示附生藻团，因此，在对鲤的胃内含物样检中，混合微型食团也占有一定比例。

s4.待挑拣完软体动物和水生植物残体，取部分混合食团于玻璃计数板表面(20mm×20mm)，转移至光学显微镜下，用蒸馏水对粘稠的混合食团进行稀释并搅匀，用盖玻片压紧至食源形变，进一步计算各微型食源占内含物总量的百分比。

在显微镜下根据各类微型食源的近似几何形状(矩形、三角形、梯形、椭圆)估算其表面积s(μm2)，由于受盖玻片紧压变形，各微型食源高度h(μm)可视为一致，在计算体积时可直接约分，所得混合食团j中微型食源j1～jm的近似表面积为sj1～sjm(μm2)，体积为vj1～vjm(μm3)，进一步计算混合食团中各微型食源所占内含物总量的体积百分比rvj1～rvjm(％)：

vjm(μm³)＝s×h

本实施例鲤胃肠内含物定量分析结果如表3所示，其主要食物类型依次为：软体动物80.92％、水生植物14.99％、有机碎屑3.39％、浮游植物0.62％、浮游动物0.08％；按照各食源组分所占比例排序依次为：淡水壳菜80.92％、河蚬14.99％、黑藻11.90％、狐尾藻3.09％、颗粒有机质2.91％、绿藻门0.48％、植物碎屑0.48％、硅藻门0.10％、桡足类0.065％、蓝藻门0.035％、枝脚类0.016％。

表3鲤胃肠内含物中各食源组分的定量分析

实施例4对滤食性鱼类鳙的食性分析

本实施例鳙样本随机采集于广东省珠江河口，胃肠解剖及内含物取样过程同实施例1。与其他鱼类物种不同，鳙以细长且排列紧密的鳃耙滤集水体中的浮游生物与颗粒物，其特殊的摄食方式决定了胃肠中无大块食物残体，只由微型混合食源组成(图5所示)。对鳙胃肠内含物中的微型食源进行定量分析，方法同实施例3中步骤s3和s4所述对鲤胃肠内含物中混合微型食团的检测和计算。鳙胃肠内含物定量分析结果如表4所示，其主要食物类型依次为：颗粒有机质56.14％、浮游动物19.69％、植物碎屑14.64％、浮游植物9.52％；按照各食源组分所占比例排序依次为：颗粒有机质56.14％、植物碎屑14.64％、轮虫7.91％、桡足类6.16％、枝脚类5.02％、蓝藻门3.86％、绿藻门5.06％、原生动物0.61％、硅藻门0.58％、金藻门0.02％、黄藻门0.002％。必须指出，除鳙外，大多数鱼类在其仔稚鱼阶段也会以浮游生物为代表的微型食源作为主要摄食对象，因此，对鳙的胃肠内含物检测过程也同样适用于仔稚鱼和幼鱼阶段的鱼类个体。

表4鳙胃肠内含物中各食源组分的定量分析