专利名称：中、日白姑鱼种群的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种白姑鱼种群的鉴定方法，特别是涉及一种用于区分与鉴别中国 和日本白姑鱼种群的方法。
背景技术：
白姑鱼Ur^7rosoM/s ar《e/2t3^s Houttuyn)属舻形目、石首鱼禾斗、白姑鱼属， 分布于印度洋和太平洋西部，是一种经济鱼类。中国沿海和日本沿海的白姑鱼因地 理、海流等因素而被隔离，其形态特征十分相似，难以从外部形态上进行鉴别和区 分。目前关于生物种质资源检测与鉴定的专利不多，如申请号为200710009323、 200610050749、 200410014259、 01114195、 01106080以及一些禾45开文献报道，主要 是有关于坛紫菜、中华鳖、石斛、海带、紫菜等物种种质资源相关的一些专利与研 究报道，尚未见到有关白姑鱼种群鉴另啲技术。由于中、日白姑鱼种群鉴另啲难度， 直接影响了对白姑鱼渔业资源的研究和 生产指导。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种简便、快捷、准确地鉴别中、 日白姑鱼种群的方法，以更好地指导渔业生产。
为解决上述问题，本发明采用特异的DNA检测方法区分中、日白姑鱼种群，具 体包含以下步骤
a. 取待测白姑鱼样品背部肌肉组织50-100mg,采用酚/氯仿抽提法提取基因组
靈；
b. 对所提取的DNA采用三斜寺异的弓卿进行PCR扩增；c.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶电泳检测结果呈现的亮 带带型确定中、日白姑鱼种群。
如上所述中、日白姑鱼种群鉴定方法，其步骤a提取待测白姑鱼基因组DNA进一 步包括
(1)将样品放入l. 5mL离心管剪碎。加入600uL STE，于振荡器上震荡均匀。 加入RNase6uL，终浓度O. 04 u g/y L， 37°。烘箱内孵育1小时；
'(2)加蛋白酶K15uL，终浓度0.5 ug/uL，颠倒混匀，于5(TC烘箱内孵育大于 8小时；
(3) 烘箱内取出后凉至室温，力口600uL平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊，离心， 小心吸取上清至另一干净离心管；
(4) 加等体积苯酚氯仿异戊醇=25: 24: 1，颠倒混匀20min,离心，小心 吸取上清至另一干净离心管；
(5) 加等体积氯仿异戊醇=24: 1，颠倒混匀20min，离心，小心吸取上清至 另一干净离心管，加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀，-2(TC存放2小时以上；
(6) 离心产生白色沉淀，轻柔倒去异丙醇，再加入800 P L 75%的预冷酒精，缓 慢颠倒洗涤DNA沉淀，再离心，弃酒精；
(7) 重复步骤6;
(8) 将DNA样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥，加入IOO pL双蒸水溶解， 置4° C冰箱待用或长期保存于-20° C待用。
如上戶脱中、日白姑鱼种群鉴定方法，其步骤b中采用引物序歹咖下
L14734-AAC CAC CGTTGTTATTCMCT
Cytb-CTCAGMTGACATTTGTCCTCA Cytb-220 AGTCACCCGTAGTTGACGTCG。本发明采用分子生物学手段，对白姑鱼DNA进行PCR扩增，在凝胶电泳检测结 果中，中国白姑鱼的DNA显示为1条亮带，日本白姑鱼的DNA显示为2条亮带，因 此，采用本方法，可以很容易地将中、日白姑鱼种群分开。简便易行，特异性高， 可以更好地指导渔业生产。
图1为本发明对白姑鱼DNA进行PCR扩增产物凝胶电泳检测结果的实际图像； 图2为图1的反转图。
具体实施例方式
本发明具体实施方案如下
a.采用酚/氯仿方法进行DNA提取对用95%酒精或-20°。冷冻保存的白姑鱼样 品，取背部肌肉组织50-100mg，采用传统方法(酚/氯仿抽提法)提取基因组DNA。 详细方法和步骤如下
(1) 将样品方j[Al. 5mL离心管剪碎。加入600pLSTE (10mmol/L TriS-Cl, pH8.0; 0. lmol/LEDTA， pH8.0; l%m/vSDS)，于振荡器上震荡均匀。加入RNase (4ug/uL) 6"，终浓度0.04ng/uL， 37。C烘箱内孵育l小时。
(2) 加蛋白酉敏(20 ug/uL) 15uL,终浓度0.5 ug/uL，颠倒混匀，于50。C烘 箱内孵育过夜(>8小时)。
(3) 烘箱内取出后凉至室温力口600uL (pH8.0)平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊 (》30min)。离心(8000g， 10min)，小心吸取上清至另一干净离心管。
(4) 加等体积苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)，颠倒混匀20min，离心(8000g， 10min)，小心吸取上清至另一干净离心管。
(5) 加等体积氯仿异戊醇(24: 1)，颠倒混匀20min，离心(8000g， 10min)， 小心吸取上清至另一干净离心管。加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀，-2(TC存放
62小时以上。
(6) 离心(10000g， 10min)产生白色沉淀，轻柔倒去异丙醇，再加入800uL75呢 的预冷酒精，缓慢颠倒洗涤DNA沉淀，再离心(10000g， 10min)，弃酒精。
(7) 重复步骤6 (注不要将DNA沉淀倒掉)。
(8) 将DNA样品置于真空干燥器或烘箱干燥(视管中乙醇残留量多少适当调整 干燥时间)；加入IOO ^L双蒸水溶解，置4。C冰箱待用或长期f呆存于-2(TC待用。
b.对所提取的DNA采用三,异的弓卿进行PCR扩增。
采用引物序列如下
L14734- MC CAC CGTTGTTATTCMCT Cytb~CTCAGAATGACATTTGTCCTCA Cytb-220 AGTCACCCGTAGTTGACGTCG
反应体系如下(ILlL:微升；mM:毫摩尔/升；uM:微摩尔/升)
10XPCR反应缓冲液(10Xbuffer: Tris-HC1 (pH8. 3) 100 mM; KC1 500 mM; MgCl2 15 mM) 2. 5|xL
2. 5毫摩尔/升脱氧核苷三磷酸(mM dNTPs)2 |iL
L14734 (10 uM) 1. 5
Cytb (10 uM) 1.3 |oL
Cytb-220(10 uM) 0.2 |iL
Taq DNA聚合酶(5 U/ul) 0. 2 (xL
DNA 2 |LiL
双蒸水补足体系至25pL 反应^i牛为反应^f牛为94 。C预变性3 min ，后经过40个循环，每个循环 包括94 °C45 s， 50 °C45 s， 72 °C45 s，最后72 。C延伸10 min。所用仪器为Eppendorf Mastercycler 5333型PCR仪。所获得PCR产物待下一 步使用。
c.对PCR产物采用琼脂M行电泳。
PCR扩增产物用1. 5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。采用北京六一仪器厂双稳定时 电泳仪(DYY-8C型)，电压为140伏特，电泳20射中。采用UVP GDS-8000凝胶成像 系统拍照检测。白姑鱼中国群体大概在450bp位置扩增出一条带，而日本群体大概 在260bp和450bp处各出现一条亮带，通过带型不同可以快速鉴别白姑鱼中、日群 体。
8
权利要求
1、一种中、日白姑鱼种的群鉴定方法，其特征是包含以下步骤a.取待测白姑鱼样品背部肌肉组织50-100mg，采用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA；b.对所提取的DNA采用三条特异的引物进行PCR扩增；c.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶电泳检测结果呈现的亮带带型确定中、日白姑鱼种群。
2、 根据权禾腰求l所述中、日白姑鱼种群的鉴定方法，其特征在于所述步骤a 提取待测白姑鱼基因组DNA进一步包括(1) 将样品放入l. 5mL离心管剪碎。加入600uL STE，于振荡器上震荡均匀。 加入RNase6uL，终浓度O. 04 u g/u L， 37。C烘箱内孵育l小时；(2) 加蛋白酶K15uL，终浓度0.5 Pg/uL，颠倒混匀，于5(TC烘箱内孵育大于 8小时；(3) 烘箱内取出后凉至室温，加600uL平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊，离心， 小心吸取上清至另一干净离心管；(4) 加等体积苯酚氯仿异戊醇=25: 24: 1，颠倒混匀20min，离心，小心 吸取上清至另一干净离心管；(5) 加等体积氯仿异戊醇=24: 1，颠倒混匀20min，离心，小心吸取上清至 另一干净离心管，加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀，-2(TC存放2小时以上；(6) 离心产生白色沉淀，轻柔倒去异丙醇，再加入800uL75y。的预冷酒精，缓 慢颠倒洗涤DNA沉淀，再离心，弃酒精；(7) 重复步骤6;(8)将DNA样品置于真空千燥器千燥或烘箱干燥，加入IOO pL双蒸水溶解， 置4° C冰箱待用或长期保存于-20° C待用。
3、根据权禾腰求l所述中、日白姑鱼种群的鉴定方法，其特征在于所述步骤b 中采用引物序列如下L14734-MC CAC CGTTGTTATTCAACT Cytb"CTCAGMTGACATTTGTCCTCA Cytb-220 AGTCACCCGTAGTTGACGTCG。
全文摘要
本发明公开了一种中、日白姑鱼种的群鉴定方法，具体包含以下步骤a.取待测白姑鱼样品背部肌肉组织50-100mg，采用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA；b.对所提取的DNA采用三条特异的引物进行PCR扩增；c.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶电泳检测结果呈现的亮带带型确定中、日白姑鱼种群。本发明采用分子生物学手段，对白姑鱼DNA进行PCR扩增，在凝胶电泳检测结果中，中国白姑鱼的DNA显示为1条亮带，日本白姑鱼的DNA显示为2条亮带，因此，采用本方法，可以很容易地将中、日白姑鱼种群分开，简便易行，特异性高。
文档编号C12N15/10GK101684485SQ200810157279
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年9月24日
发明者奎 游, 韩志强, 高天翔 申请人:中国海洋大学