引起cvm相关的snp的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明的检测引物组包括包括检测引物和探针：所述的检测引物：CVM?SLC35A3-FWD：AGCTGG?CTCACAATTTGTAGGT；CVM?SLC35A3-REV：TCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；所述的探针：针对CVM突变的探针，TCATGGCATTTCTCA；针对CVM野生的探针，TCATG?GCAGTTCTCA。本发明建立了一种通过荧光定量PCR检测牛CVM有害基因携带者的方法，本发明的方法简单、快速、准确，并且通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒，本发明为奶牛CVM有害基因的分型和筛选提供了新的方法和思路，为我国奶牛的检验检疫事业把好国门关口，为奶牛的分子选育提供了可靠的理论依据。
【专利说明】引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及引起CVM相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】:
[0002]CVM,其全称是Complex Vertebral Malformation,即“脊椎畸形综合症”。它是2001年丹麦Agerholm等发现荷斯坦牛群存在一个隐性遗传缺陷基因，纯合时可以造成妊娠早期流产、死胎或犊牛出生后很快死亡，患畜最显著的特征为颈椎弯曲畸形、两前腿筋腱缩短、颈短、心脏崎形等综合症状，故称“脊椎崎形综合症”。
[0003]脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation, CVM)是由常染色体上SLC35A3基因单碱基突变(G —T)引起的隐性遗传疾病，该基因隐性纯合(CV/CV)时奶牛致死，但CVM携带者表现正常，所以CVM携带者公牛可以通过人工授精技术传播CVM缺陷基因。
[0004]近几年，在美国、加拿大、日本等国家都相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种方案，并在种公牛系谱上进行了明确标注阴性有害基因的携带情况，合理的指导种公牛的选种和选配，有效的降低了隐性有害基因CVM的不良影响。目前，国外CVM有害基因的分子检测方法主要有ASR-PCR方法，但是ASR-PCR方法对DNA聚合酶具有很高要求，而且必须严格控制反应条件才能达到一定的准确性；而PCR-PIRA法虽然比AS-PCR法有所改进，但PCR-PIRA法要求建立阳性对照才能保证其准确性，而且不适合规模化检测，成本较高。所以，建立一种准确、快速、经济的检测CVM有害基因的分子方法是非常有必要的。
[0005]单核苷酸多态(SNP)是指有单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态，有时括有多个核苷酸插入或缺失造成的点突变。通常情况下是一种2等位基因的变异，并多为转换，即嘧啶碱基之间的转换或嘌呤碱基之间的转换。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C-T，因为CG中的C常为甲基化的，自发脱落后变为T。SNP是人类基因组中数量最多的一种多态形式，人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP。SNP的分布不均匀，非转录区要多于转录区，大多数位于蛋白的非编码区。其中相当多的SNP位点直接或间接与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性或抵抗能力有关。SNP检测在临床及临床相关研究中已有广泛应用。
[0006]Taqman探针法荧光定量PCR技术原理是针对同一 SNP位点的不同基因型设计两条不同的Taqman探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该中基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测的SNP位点上是纯合子，如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子。
【发明内容】
:[0007]本发明的目的是提供一种引起牛脊椎畸形综合症(CVM)相关的SNP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法，利用本发明的检测引物组和检测试剂盒，按照本发明的检测方法能够准确、快速、经济的检测出牛脊椎畸形综合症(CVM)，本发明具有准确、快速、经济、准确性高的优点。
[0008]本发明的引起CVM相关的SNP的检测引物组，其特征在于，包括检测引物和探针:
[0009]所述的检测引物:
[0010]CVM SLC35A3-FWD: AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT ;(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0011]CVM SLC35A3-REV: CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.;(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0012]所述的探针:
[0013]针对CVM 突变的探针，CVM SLC35A3-M:TCATGGCATTTCTCA (如 SEQ ID N0.3 所示)
[0014]针对CVM 野生的探针，CVM SLC35A3-W:TCATGGCAGTTCTCA (如 SEQ ID N0.4 所示)。
[0015]本发明的引起CVM相关的SNP的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括检测引物和探针:
[0016]所述的检测引物:
[0017]CVM SLC35A3-FWD: AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT ;(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0018]CVM SLC35A3-REV: CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.;(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0019]所述的探针:`[0020]针对CVM 突变的探针，CVM SLC35A3-M:TCATGGCATTTCTCA (如 SEQ ID N0.3 所示)
[0021]针对CVM 野生的探针，CVM SLC35A3-W:TCATGGCAGTTCTCA (如 SEQ ID N0.4 所示)。
[0022]本发明的第三个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的引起CVM相关的SNP的检测方法，其特征在于，使用上述检测引物组，对待测牛的DNA样品进行荧光定量PCR反应，根据扩增情况判断待测牛的基因型。
[0023]所述的PCR反应，其反应体系优选为:
[0024]
【权利要求】
1.引起CVM相关的SNP的检测引物组，其特征在于，包括检测引物和探针:所述的检测引物:CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT ；CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；所述的探针:针对 CVM 突变的探针，CVM SLC35A3-M:TCATGGCATTTCTCA ；针对 CVM 野生的探针，CVM SLC35A3-W:TCATGGCAGTTCTCA。
2.一种引起CVM相关的SNP的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括检测引物和探针:所述的检测引物:CVM SLC35A3-FWD:AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT ；CVM SLC35A3-REV:CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAG.；所述的探针:针对 CVM 突变的探针，CVM SLC35A3-M:TCATGGCATTTCTCA ；针对 CVM 野生的探针，CVM SLC35A3-W:TCATGGCAGTTCTCA。
3.一种非疾病的诊断和治疗目的的引起CVM相关的SNP的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的检测引物组，对待测牛的DNA样品进行荧光定量PCR反应，根据扩增情况判断待测牛的基因型。
4.根据权利要求3所述的的检测方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应，其反应体系为:
【文档编号】C12N15/11GK103710443SQ201310699024
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】吴晓薇, 朱道中, 马保华, 刘中勇, 刘志玲, 佟铁铸 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心