一种cyp4f2*3的检测引物组合物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种CYP4F2*3的检测引物组合物、试剂盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技术，利用PNA?C封闭rs2108622的C等位基因，PNA?T封闭rs2108622的T等位基因，PNA?I封闭高度相似基因CYP4F3，以保证扩增的特异性，从而使得对应的LAMP反应无法继续，以此达到CYP4F2*3突变型等位基因检测的目的，给华法林的安全使用带来更可靠的保障。该发明具有的优点在于该方法步骤简单，特异性高，鉴定简便，成本低廉，便于临床检验大范围普及。
【专利说明】
-种CYP4F2巧的检测引物组合物、试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其是设及一种CYP4F2*3的检测引物组合物、试 剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 华法林，是一种香豆素类抗凝剂，作为临床应用最为广泛的抗凝药物之一，具有价 格低廉，小剂量即可起效等优点，主要用于防治静动脉血栓栓塞性疾病，适用患者人群为屯、 脏瓣膜置换、房颤、深静脉血栓和肺栓塞患者。但是，目前在临床上，华法林的用药面临一个 严重的问题，即华法林的给药剂量非常难W掌握，剂量不足会导致体内血栓的产生，而剂量 稍大则会加大出血的倾向。
[0003] 目前，国内外临床工作者们多采用定期监测国际标准化比值（INR)和凝血酶原时 间（PT)两种手段监测华法林的临床药效。而近年来，对于华法林药效学影响因素的研究热 点则主要集中在遗传药物基因组学方面运个研究领域。由于华法林的抗凝作用主要由S-华 法林产生，而S-华法林的体内代谢主要是由细胞色素 P450酶超家族中的CYP2C9完成， CYP2C9可W催化人体内的华法林成为无活性形式6-或7-径基华法林，所WCYP2C9的活性对 华法林的抗凝治疗效果有着十分重要的影响。除此之外，另外一种等位基因 CYP4F2的遗传 多态性与华法林剂量也有不可忽视的关联。CYP4F2*3(rs2108622C〉T，V433M)可导致细胞色 素药物酶活性降低，相反患者体内维生素 K的浓度会增高，所W携带运种突变型等位基因的 患者在使用华法林时，体内出血风险与野生型等位基因携带者相比会大大增高。因此，临床 上在使用华法林进行治疗的过程中，对于CYP4F2*3突变型等位基因的检测，会给华法林的 安全使用带来更可靠的保障。
[0004] 目前，临床及市场上针对CYP4F2的突变型等位基因检测已经有了商品化的试剂 盒，运些试剂盒所采用的技术主要包括化qman-MGB巧光探针法、液相忍片法、一代测序法和 二代测序法。运些技术手段均在不同方面展现出了自己的优势，但是也都普遍存在检测仪 器及配套试剂耗材购买成本高昂，检测周期长、操作繁琐且假阳性率时有出现的问题。因 此，发明并构建一套价格低廉，使用操作简便且利于临床检验大范围普及的商品化试剂盒 就显得十分重要。环介导的等溫扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等溫扩 增技术，其主要特点是针对祀基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下进行恒溫扩增，仅需15-90分钟即可产生109-l〇w数量级的产物， 具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
[0005] LAMP法具有操作简单，特异性强和成本低廉的优点。目前LAMP法较多用于病原体 和其他一些微生物的检测中，虽然对于使用LAMP法进行基因突变的检测也偶见报道，但运 些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很不稳定，因此在市场上还没有WLAMP法 为基础的基因突变检测试剂盒出售。肤核酸(PM)是具有类多肤骨架的DNA类似物，骨架是 由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基幾基连接而成的。PNA可W特异性地与DNA 或RNA杂交，形成稳定的复合体。当PM与祀序列完全互补时，运种复合体的稳定性要远远高 于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。然而，当PM与祀序列不完全配对甚至只 有一个碱基错配的时候，运种PNA-DNA复合物就变得非常不稳定，很容易打开双链。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是现有的CYP4F2*3突变型等位基因的检测存在费用高， 检测周期较长，操作繁琐且假阳性率时有出现等问题，不利于临床检验大范围普及。
[0007] 为解决上述问题，本发明采用PNA Clamp LAMP技术，利用PNA-C封闭rs2108622的C 等位基因，PNA-T封闭rs2108622的T等位基因，PNA-I封闭高度相似基因 CYP4F3,从而使得相 应的LAMP反应无法继续，W此实现CYP4F2*3突变型等位基因的检测，该方法既快速灵敏又 成本低廉，可给华法林的安全使用带来更可靠的保障。
[000引本发明的第一个目的在于提供一种CYP4F巧3的检测引物组合物，包括：
[0009] 正向外侧引物F3:
[0010] 5'-ATCAAAACCCTGCCCCCT-3'（沈Q ID No.l);
[00川反向外侧引物B3:
[0012] 5'-GGGTCATCCCCAAAGGTG-3'（沈Q ID No.2);
[OOU] 正向内侧引物FIP:
[0014] 5 '-GGAACCCATCACAACCCAGCTGAGGAGCCTTGGAATGGACA-3 '（沈Q ID No.3);
[001引反向内侧引物BIP:
[0016] 5'-ATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGAGTCTCCTGGGTAGGAAGAG-3'（沈Q ID No.4);W及
[0017] 用于封闭rs2108622C等位基因的肤核酸序列PNA-C:
[001 引 5'-GCCACACAGCTGGGTT-3'（沈Q ID No.5);
[0019] 用于封闭rs2108622T等位基因的肤核酸序列PNA-T:
[0020] 5'-GCCACATAGCTGGGTT-3'（沈Q ID No.6);
[0021] 用于封闭CYP4F3的肤核酸序列PNA-I:
[0022] 5'-ACAATGCTCCCTGCC-3'（沈Q ID No.7)。
[0023] 本发明的第二个目的在于提供一种CYP4F2*3的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括 上述的引物和肤核酸序列。
[0024] 进一步地，所述检测试剂盒中还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
[0025] 进一步地，所述检测试剂盒分为两个反应体系，分别记为反应体系C和反应体系T:
[0026] 反应体系C中包括。3、83少1?、81?、？魁-(：、？魁-1、(1^?、缓冲液、831聚合酶和超纯 水;反应体系T中包括。3、83^1?、81?、？臟-1\?臟-1、(1饥1\缓冲液、831聚合酶和超纯水。
[0027] 进一步地，所述两个反应体系中还包括用于显示体系颜色的指示剂。
[0028] 优选地，所述指示剂为径基糞酪蓝。
[0029] 优选地，所述指示剂在反应体系C和反应体系T中的浓度相同，径基糞酪蓝的浓度 为 120iiM。
[0030] 进一步地，所述两个反应体系中还包括添加剂，所述添加剂在两反应体系中的浓 度一致。
[0031 ]优选地，所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。
[0032] 优选地，所述两个反应体系中缓冲液的浓度相同，其包括：TriS-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1 % (体积分数）。
[0033] 优选地，所述两个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4iiM;B3的浓度相同，均为0.4 iiM;FIP的浓度相同，均为1.6iiM;BIP的浓度相同，均为1.6iiM，PNA-I的浓度相同，均为0.4iiM; 反应体系C中的PNA-C的浓度和反应体系T中PNA-T的浓度相同，均为0.4iiM。
[0034] 优选地，两个反应体系中dNTP的浓度相同，均为1.4mM;两个反应体系中Bst聚合酶 的浓度相同，均为8U。
[0035] 本发明的第S个目的在于提供一种CYP4F2*3的检测方法，其使用上述的检测试剂 盒，包括如下步骤：
[0036] (1)抽取静脉血W邸TA抗凝管保存；
[0037] (2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA或全血直接作为待检测的模板，同时W超 纯水代替模板做阴性对照；
[003引 （3)采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体 系C和反应体系T中，于65°C下反应，然后升溫至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后降溫， 观察体系颜色变化。
[0039] 进一步地，所述反应时间为60~SOmin。
[0040] 在本发明的两个反应体系中，当反应体系中存在指示剂时，选用径基糞酪蓝作为 指示剂时，反应前体系中的儀离子与dNTP馨合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，儀离 子与副产物焦憐酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。因此，观 察反应体系颜色的变化就可W直接判定是否发生扩增反应。
[0041] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0042] 本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基 因"封闭"，从而使得LAMP反应无法继续;而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因 时，PNA由于不能有效对其进行"封闭"，使得LAMP反应得W顺利进行，W此达到CYP4F2基因 分型检测的目的。
[0043] 与现有技术相比，PNA Clamp LAMP法具有如下有益效果：
[0044] (1)步骤简单:LAMP法本身对模板的要求并不严格，其反应模板甚至可W是DNA的 粗提物，只需反应体系配置完毕后放置在恒溫水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进 行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变溫过程；
[0045] (2)高特异性:多条引物共同参与反应，相较于普通PCR具有很高的特异性；
[0046] (3)扩增反应快速、高效:整个扩增化内即可完成，且产率高；
[0047] (4)鉴定简便:反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可W 脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制；
[0048] (5)成本低廉:整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。
【附图说明】
[0049] 图1-图3分别是检测样本M1-M3用PCR测序分型得到的测序图谱。
【具体实施方式】
[0050] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但 不限定本发明的保护范围。
[0化1 ] 一种CYP4F巧3的检测引物组合物，包括：
[0化2] 正向外侧引物F3:
[0053] 5'-ATCAAAACCCTGCCCCCT-3'（沈Q ID No.l);
[0化4] 反向外侧引物B3:
[0055] 5'-GGGTCATCCCCAAAGGTG-3'（沈Q ID No.2);
[0化6] 正向内侧引物FIP:
[0057] 5 '-GGAACCCATCACAACCCAGCTGAGGAGCCTTGGAATGGACA-3 '（沈Q ID No.3);
[0化引反向内侧引物BIP:
[0059] 5'-ATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGAGTCTCCTGGGTAGGAAGAG-3'（沈Q ID No.4);W及
[0060] 用于封闭r S 2108622C等位基因的肤核酸序列PNA-C:
[0061 ] 5'-GCCACACAGCTGGGTT-3'（沈Q ID No.5);
[0062] 用于封闭rs2108622T等位基因的肤核酸序列PNA-T:
[0063] 5'-GCCACATAGCTGGGTT-3'（沈Q ID No.6);
[0064] 用于封闭CYP4F3的肤核酸序列PNA-I:
[00化]5'-ACAATGCTCCCTGCC-3'（沈Q ID No.7)。
[0066] 一种CYP4F2*3的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的引物和肤核酸序列，还 包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱。
[0067] 所述检测试剂盒分为两个反应体系，分别为检测rs2108622C等位基因的反应体系 C和检测rs2108622T等位基因的反应体系T。反应体系C中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-C、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱;反应体系T中包括F3、B3、FIP、 6化？臟-1\?臟-1、(1饥1\缓冲液、83*聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱。
[0068] 两反应体系中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置，作为一种实施方案， 两个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4iiM;B3的浓度相同，均为0.4iiM;FIP的浓度相同，均 为1.6iiM;BIP的浓度相同，均为1.6iiM;PNA-I的浓度相同，均为0.4咖;反应体系C中的PNA-C 的浓度和反应体系T中PNA-T的浓度相同，均为0.4測;dNTP的浓度相同，均为1.4mM;Bst聚合 酶的浓度相同，均为洲;缓冲液的浓度相同，均包括:TriS-HCl 20mM，KCl 50mM，（畑4)2S化 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1 % (体积分数）；径基糞酪蓝的浓度相同，均为120測;甜菜碱 的浓度相同，均为0.8M。
[0069] 一种CYP4F2*3的检测方法，使用上述的检测试剂盒，具体为:抽取静脉血W抓TA抗 凝管保存；用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为待检测的模板，W超纯水代替模板做阴 性对照;采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系C 和反应体系T中，于65°C下反应，然后升溫至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后降溫，观 察体系颜色变化。作为优选，所述反应时间为60~80min。
[0070] 具体实施时，抽取3人Iml静脉血W抓TA抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金 或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为待检测的模板， 分别标记为Ml、M2和M3，另有一 W超纯水代替模板的阴性对照，记为M4 ;对模板采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，分为两组反应体系，一组针对C等位基因的反应体系C，另 一组为针对T等位基因的反应体系T，两个反应体系中的指示剂均为径基糞酪蓝，添加剂均 为甜菜碱;将模板Mn(n为组别编号，1-4)分别加入到反应体系C和反应体系T中，得到反应体 系C和T，模板Mn在两反应体系中的浓度一致，均为40ngAiL(实际操作中可W是S-IOOngAiL 均可），两个反应体系反应时，于65°C下反应70min，之后升溫至80°C保持20min进行灭活处 理，之后降溫，观察体系颜色变化。
[0071] 利用检测试剂盒对模板Mn进行检测，作为一种实施方式，检测试剂盒的两个反应 体系各为2如L，其内的组分和含量如下表1和表2所示：
[0072] 表1反应体系C的组分和含量
[0075] 表2反应体系T的组分和含量
[0073]
[0074]
[0076]
[0077] 反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别 反应体系的颜色及基因型判断如下表3所示：
[0078] 表3各组别反应体系的颜色及基因型判断
[0079]
[0080] 由上表可知，编号为3的祥本反应体《C和反应体《T均变为大蓝色，证明两个反应 体系中均发生阳性反应，表明编号为3的样本在rs2108622位点处基因型为CT;编号为I的样 本则是反应体系T保持紫罗兰色，反应体系C变为天蓝色，判定为TT基因型；编号为2的样本 则是反应体系C保持紫罗兰色，反应体系T变为天蓝色，判定为CC基因型。
[0081] 为进一步验证反应的准确性，将上述3个实验组别的模板M1-M3分别用PCR测序法 进行分型，得到的测序图谱参见图1-图3。
[0082] 对比基因测序图谱和本发明提供的检测试剂盒的检测结果可知，二者的检测吻合 率100 %，验证了本发明的结果精确。
[0083] W上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种CYP4F2*3的检测引物组合物，其特征在于:包括： 正向外侧引物F3: 5'-ATCAAAACCCTGCCCCCT-3'（SEQ ID No.l); 反向外侧引物B3: 5'-GGGTCATCCCCAAAGGTG-3'（SEQ ID No.2); 正向内侧引物FIP: 5 '-GGAACCCATCACAACCCAGCTGAGGAGCCTTGGAATGGACA-3 '（SEQ ID No·3); 反向内侧引物BIP: 5 ' -ATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGAGTCTCCTGGGTAGGAAGAG-3 '（ SEQ ID No · 4);以及 用于封闭rs2108622C等位基因的肽核酸序列PNA-C: 5'-GCCACACAGCTGGGTT-3'（SEQ ID Νο·5); 用于封闭rs2108622T等位基因的肽核酸序列ΡΝΑ-Τ: 5'-GCCACATAGCTGGGTT-3'（SEQ ID Νο·6); 用于封闭CYP4F3的肽核酸序列ΡΝΑ-Ι: 5'-ACAATGCTCCCTGCC-3'（SEQ ID No.7)。2. -种CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和肽核酸序 列。3. 根据权利要求2所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于：还包括dNTP、缓冲液、 Bst聚合酶和超纯水。4. 根据权利要求3所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述检测试剂盒分为两 个反应体系，分别记为反应体系C和反应体系T: 反应体系C中包括?3、83、？1?、81?、？嫩-(^嫩-1、(1犯1\缓冲液、88七聚合酶和超纯水； 反应体系T中包括?3、83、？1?、81?、？嫩-1\?嫩-1、(1犯1\缓冲液、88七聚合酶和超纯水。5. 根据权利要求4所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述两个反应体系中还 包括用于显示体系颜色的指示剂。6. 根据权利要求5所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述指示剂为羟基萘酚 蓝。7. 根据权利要求6所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述指示剂在反应体系 C和反应体系T中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μΜ。8. 根据权利要求4所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述两个反应体系中还 包括添加剂，所述添加剂在两个反应体系中的浓度一致。9. 根据权利要求8所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述添加剂为甜菜碱， 甜菜碱的浓度为0.8M。10. 根据权利要求4-9中任一项所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述两个 反应体系中缓冲液的浓度相同，其包括:Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (体积分数）。11. 根据权利要求4-9中任一项所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:所述两个 反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4μΜ; B3的浓度相同，均为0.4μΜ; FIP的浓度相同，均为 1.6μΜ;ΒΙΡ的浓度相同，均为1.6μΜ;ΡΝΑ-Ι的浓度相同，均为0.4μΜ;反应体系C中的PNA-C的 浓度和反应体系T中PNA-T的浓度相同，均为0.4μΜ。12. 根据权利要求4-9中任一项所述的CYP4F2*3的检测试剂盒，其特征在于:两个反应 体系中dNTP的浓度相同，均为1.4mM;两个反应体系中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。13. -种CYP4F2*3的检测方法，使用权利要求3-12任一所述的检测试剂盒，其特征在 于:包括如下步骤： (1) 抽取静脉血以Η)ΤΑ抗凝管保存； (2) 用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA或直接以全血作为待检测的模板，以超纯水代 替模板做阴性对照； (3) 采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系C 和反应体系T中，于65°C下反应，然后升温至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后降温，观 察体系颜色变化。14. 根据权利要求13所述的CYP4F2*3的检测方法，其特征在于：所述反应时间为60~ 80min〇
【文档编号】C12Q1/68GK105861688SQ201610298682
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】汪大为, 张井存
【申请人】北京晋祺生物科技有限公司