一种检测七星瓢虫的引物对、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测七星瓢虫的引物对，所述引物对序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。本发明还涉及含有所述引物对的试剂盒及用引物对和试剂盒检测七星瓢虫的检测方法。本发明的检测方法简单、快速、特异、灵敏。
【专利说明】一种检测七星瓢虫的弓I物对、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体而言，涉及用于检测七星瓢虫的引物对、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]七星瓢虫Coccinella septempunctata L.是一种鞘翅目瓢虫科捕食性天敌昆虫，成虫和幼虫可捕食麦蚜、棉蚜、槐蚜、桃蚜、介壳虫、壁虱等害虫，减轻树木、瓜果及各种农作物遭受害虫的损害，被人们称为“活农药”。除了冬季外，户外有蚜虫发生的地方均有机会找到前来觅食的七星瓢虫成虫，但其较少成群聚集。一年发生多代，以成虫过冬，次年4月出蛰，产卵于有蚜虫的植物上。分布范围广，在中国(北京、河北、黑龙江、吉林、河南、陕西、甘肃、新疆、西藏、云南、贵州、四川、湖北、湖南、浙江、福建、广东、广西、海南、台湾等)、蒙古、朝鲜、日本、印度、前苏联、古北区、欧洲都有它的踪迹。
[0003]七星瓢虫成虫体长:5.2-7.0mm,体宽:4.0-5.6mm。体周缘卵形,背面光滑无毛。头黑色。前胸背板黑色，在其前角上各有一个大型近于四边形的淡黄色斑，伸展到缘折上形成窄条。小盾片黑色。鞘翅红色或橙红色，两鞘翅·上共有7个黑斑，其中位于小盾片下方的小盾斑被鞘翅分割为两边一半，其余每一鞘翅上各有3个黑斑。鞘翅基部靠小盾片两侧各有一个小三角形的白斑。七星瓢虫以鞘翅上有7个黑色斑点而得名。每年发生世代数因地区不同而异。例如，在河南安阳地区每年发生6-8代。北方寒冷地区，发生世代数则较少。七星瓢虫成虫寿命长，平均77天。I头七星瓢虫雌虫可产卵567-4475粒，平均每天产卵78.4粒，最多可达197粒。七星瓢虫取食量大小与气温和猎物密度有关。以捕食蚜虫为例，在猎物密度较低时，捕食量随密度上升而呈指数增长；在密度较高时，捕食量则接近极限水平。较高的气温可影响七星瓢虫的活动能力，提高其捕食率。据统计，不同虫态七星瓢虫对烟蚜的平均日取食量分别为:I龄10.7头，2龄33.7头，3龄60.5头，4龄124.5头，成虫130.8头。七星瓢虫近80天的生命期可取食上万头蚜虫。七星瓢虫对人、畜和天敌动物无毒无害，作为农田重要的天敌昆虫，其合理利用可减轻农药使用，减少环境污染，取得良好的经济和生态效益。早在20世纪70年代黄河下游地区即已用助迁法利用七星瓢虫防治棉花和小麦蚜虫，90年代开始人工繁殖，并用于生产。
[0004]瓢虫种类全世界记载约500属5000种，中国已记录近400种。种类繁多且仅根据形态描述准确判断瓢虫种类有一定的难度。此外，不同瓢虫间还普遍存在集团内捕食的现象，但常规的肠道解剖、行为观察等方法无法准确评估这种重要的捕食关系。因此要更好地鉴定瓢虫种类及研究瓢虫的集团内捕食作用，需要建立一套快速而准确的分子检测方法，但目前对于七星瓢虫尚没有标准的检测方法。聚合酶链式反应(polymerase chainreaction, PCR)技术可根据物种特异性引物清楚区分至种，以其特异性强、灵敏度高、简便快速的特点在物种种类鉴定中占据重要地位。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是:提供一种快速、简单、特异且灵敏地检测七星瓢虫的鉴定方法。
[0006]为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种用于检测七星瓢虫的引物对，所述引物对序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列。
[0007]本发明还提供一种含有SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示序列的引物对的试剂盒。
[0008]本发明还提供一种检测七星瓢虫的方法，包括用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒进行PCR扩增的步骤。
[0009]具体步骤为，从样品中提取基因组DNA为模板；利用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒中的弓I物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；检测扩增产物，并作出判断。
[0010]所述PCR 反应体系为 20 μ L，其中 10 X EasyTaq buffer2.0 μ L、dNTP (2.5mM)
0.4μ UEasyTaq聚合酶(5U/y L) 0.2 μ L、上游引物和下游引物(10p/mol)各0.4 μ L、样品基因组DNAL O μ L、超纯水15.6 μ L。
[0011]所述PCR扩增程序为94°C预变性4min ;94°C变性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s, 40个循环。
[0012]所述检测扩增产物是采用 电泳检测，出现189bp左右的特异性扩增条带即判断为检出七星瓢虫。
[0013]本发明提供了前述引物对及试剂盒在检测七星瓢虫中的应用。
[0014]本发明弓I物对是通过通用弓丨物对L印Fl (ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG)和L印Rl (TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA)扩增不同瓢虫线粒体细胞色素氧化酶I亚基(cytochromeoxidase subunit I，C0I)基因序列进行比对设计得到。
[0015]使用本发明的引物对，能够特异、灵敏地扩增出目的片段。
[0016]使用本发明的引物对进行检测，实施例显示，只有七星瓢虫特异性产生189bp的扩增条带，其他58种近源种、属瓢虫以及其他昆虫均未产生189bp的扩增条带。结果表明建立的PCR方法具有良好的特异性，可用于七星瓢虫的检测。
[0017]使用本发明的引物对进行检测，可从七星瓢虫DNA浓度为0.375ng/ μ L的样品中成功检测出七星瓢虫。具有较高的灵敏度，符合日常检测的要求。
[0018]使用本发明的引物对进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点；本发明的PCR检测方法，具有高效、快速和敏感性高的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为七星瓢虫引物CsF6/R6特异性检测琼脂凝胶电泳图(1_114为棉田常见昆虫模板；M:DNA分子量标准2000bp ladder ； 一:阴性对照)。
[0020]图2为七星瓢虫引物CsF6/R6质粒浓度梯度检测琼脂凝胶电泳图(1_7为模板质粒浓度1.385541649E+07依次10倍稀释浓度梯度；一:阴性对照；M:DNA分子量标准2000bp ladder)。
[0021]图3为七星瓢虫引物CsF6/R6DNA浓度梯度检测琼脂凝胶电泳图(1-7为模板DNA浓度3ng/ μ L依次2倍稀释浓度梯度；一:阴性对照；M:DNA分子量标准2000bp ladder)。【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0023]实施例1检测引物CsF6/R6对七星瓢虫的扩增效果
[0024](I)瓢虫模板DNA的制备
[0025]将单头瓢虫放入1.5ml离心管中将其磨碎,用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生物(北京)有限公司)提取单头瓢虫
基因组。
[0026](2)合成检验七星瓢虫的特异性COI引物
[0027]本发明弓I物对是通过通用弓I物对L印Fl (ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG)和L印Rl (TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA)扩增不同瓢虫线粒体细胞色素氧化酶I亚基(cytochromeoxidase subunit I， C0I)基因序列进行比对设计得到。
[0028]设计得到检验七星瓢虫的特异性COI引物对:
[0029]Primer CsF6:5，-AATATACGACCATTTGGC-3，
[0030]Primer CsR6:5，-TTGATAAAGGATGGGATCT-3’
[0031](3)进行PCR扩增反应
[0032]I)反应体系
[0033]反应体系为20 μ L，其中 IOX EasyTaq buffer2.0 μ L、dNTP (2.5mM) 0.4 μ L、EasyTaq聚合酶(5U/ μ L) 0.2 μ L、上游引物和下游引物(I Op/mo I)各0.4 μ L、模板DNAL O μ L、超纯水 15.6μ L0
[0034]2) PCR扩增程序
[0035]本发明PCR扩增程序为94°C预变性4min ;94°C变性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s, 40个循环。
[0036](4)鉴定PCR产物
[0037]取10 μ L产物用1.0% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化以锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
[0038](5)实施结果
[0039]利用引物CsF6/CsR6以七星瓢虫基因组DNA为模板，以常见瓢虫以及其他昆虫种类(见表I)为对照进行PCR扩增，扩增结果见图1。从图1中可以看到，利用引物CsF6/CsR6扩增后，在1、2泳道的七星瓢虫中扩增出了 189bp的目的条带，在其他3-114泳道中均无扩增产物。说明本发明的特异性PCR引物CsF6/CsR6的特异性强。扩增出的189bp片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0040]表I引物种特异性检验中所用的昆虫种类
[0041]
【权利要求】
1.一种用于检测七星瓢虫的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列。
2.含有权利要求1所述引物对的试剂盒。
3.—种检测七星瓢虫的方法，其特征在于，包括用权利要求1的引物对进行PCR扩增的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从样品中提取基因组DNA为模板；利用权利要求I所述的引物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；检测扩增产物，并作出判断。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为20yL，其中IOXEasyTaq buffer2.0 μ L.dNTP (2.5mM) 0.4 μ UEasyTaq 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L、上游弓丨物和下游引物(10p/mol)各0.4μ L、样品基因组DNA1.0μ L、超纯水15.6 μ L0
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为94°C预变性4min;94°C变性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s，40个循环。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的检测扩增产物是采用电泳检测，出现189bp左右的特异性扩增条带即判断为检出七星瓢虫。
8.权利要求1所述的引物对在检测七星瓢虫中的应用。
9.权利要求2所述的 试剂盒在检测七星瓢虫中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103436617SQ201310373403
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】杨帆, 王倩, 陆宴辉, 徐建祥 申请人:中国农业科学院植物保护研究所