PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是指一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物 及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] ACPP (前列腺酸性磷酸酶，）是编码非特异性酪氨酸磷酸酶，在酸性（PH4-6)条件 下，此酶对多种底物具有去磷酸化作用。ACPP底物包括烷基，芳基和酰基的正磷酸单酯和磷 酸化蛋白质。在雄性激素的调控下前列腺上皮细胞合成ACPP，并分泌到精液中。在前列腺 中ACPP mRNA的表达量是任何其他组织的100倍以上。利用ACPP抗体进行IHC染色显示 在前列腺组织中细胞内和细胞间均出现很明显的免疫组化染色反应，证明ACPP是一种前 列腺特异基因。ACPP蛋白能在血清中被检测出来。在病理状态下，前列腺上皮细胞会脱落 进入血液和尿液中。受损的前列腺上皮细胞将释放出ACPP mRNA和蛋白质成分。自1940 年以来，血清ACPP -直被作为前列腺癌的诊断标志物。但是，ACPP在前列腺癌变，特别是早 期癌变中变化不大，八十年代，ACPP检测被PSA (Prostate Cancer membrane Antigen，又 称KLK3)检测取代了。前列腺癌特异性基因（如PCA3mRNA)的表达已被用于前列腺癌的诊 断。然而，单个基因的定量检测可能受到多方面的干扰，如：样品中前列腺上皮细胞的RNA 总量以及RNA百分含量等。一些持家基因如GAPDH和肌动蛋白已被证明可用作内控。然而， 他们都存在的缺陷。在前列腺癌的发展过程中GAPDH mRNA表达水平会发生变化，而肌动 蛋白和TBP可在其他组织中表达，降低分析的准确性。这些问题对仅能获得少量样本的恶 性肿瘤的早期检测或筛查影响很大。ACPP mRNA作为定量内控远远优于上述提到的那些内 控：第一，ACPP mRNA在前列腺中有很高的表达，并能够容易且可靠地检测出来。第二，ACPP mRNA仅在前列腺上皮细胞中表达，特异性强。第三，在正常前列腺上皮细胞与前列腺肿瘤细 胞中ACPP mRNA表达水平基本一致。因此，ACPP mRNA水平是一个非常好的细胞定量的内 控（内参）基因，提供样品中前列腺上皮细胞含量的信息。前列腺特异性基因 ACPP mRNA的 定量分析提供了一个敏感的方法，可用于生物活检标本或循环系统的前列腺癌细胞样本中 前列腺上皮细胞的定量检测。它可以被用来监测前列腺癌扩散到循环系统和其他器官的情 况。当与其他标记物相结合时，它也可以用于前列腺癌的高度准确的筛查。
[0003] 通过Northern blot法分析正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌细胞及其转 移灶，PCA3基因特异性地高度表达于人类前列腺癌细胞，正常前列腺、良性前列腺增生细胞 中仅少量表达。Bussemakers在56例前列腺癌患者中就发现有53例的PCA3基因强阳性， 肿瘤组织与癌旁组织相比，其表达量上调10-100倍，但是肿瘤组织PSA mRNA的表达与前列 腺增生组织相比没有明显差别，因此认为与PSA相比，PCA3基因是一个前列腺癌特异性很 强的基因。这表明PCA3mRNA可以作为诊断前列腺癌或者判断预后的有价值的肿瘤标记物。 使PCA3表达具有前列腺癌特异性的基因启动子可以为前列腺癌的基因治疗提供新的分子 生物学工具。Bussemakers在前列腺癌组织中均观察到PCA3基因的表达，这表明PCA3可 能是前列腺癌发生发展中的早期事件，其表达的上调可能提示肿瘤的发生，或者提示PCA3 基因在前列腺癌发生发展过程中起着一定的作用。PCA3基因的表达量随着肿瘤细胞恶性 程度的增加有逐渐增强的趋势，提示PCA3基因对于前列腺癌的临床分期及病理分级有潜 在价值。运用高灵敏度的RT-PCR技术，在正常人动脉、大脑、乳腺、膀胱、结肠、十二指肠、 心脏、肝脏、肺、睾丸、胰腺、胎盘、精囊、肌肉、皮肤、脾脏、卵巢等中均未见PCA3表达，来源 于乳腺、十二指肠、睾丸、卵巢的肿瘤组织中也未见PCA3基因表达。分析前列腺癌的八种细 胞系，分别是 ALVA-31、DU-145、JCA-1、LNCaP、PC-3、PPC-1 和 TSU-pr 1，发现 PCA3 基因仅在 LNCaP细胞系中表达，LNCaP细胞为雄激素依赖细胞系，PC-3、DU-145等为雄激素非依赖细 胞系，PCA3基因在PC-3、DU-145中表达缺失可能提示PCA3基因前列腺癌细胞在由激素依 赖向非依赖的转变过程中起着一定作用，研究PCA3基因的功能可能会给前列腺癌由激素 依赖向非依赖转变的机制提供新的思路。PCA3基因多表达于前列腺癌上皮细胞，而不是基 质细胞，通过RISH(RNA原位杂交）法可以证实。
[0004] 同样，de Kok等研究发现PCA3是诊断前列腺癌的特异性、高灵敏性的工具。运用 实时定量的RT-PCR技术，能准确量化地检测PCA3。它具有诊断前列腺癌和判断其预后的价 值。de Kok等运用实时定量RT-PCR技术，绝对定量正常前列腺、前列腺增生组织、前列腺癌 组织中PCA3拷贝数，同时定量各样本中rRNA拷贝数，取其比值来减少样本间差异。为了比 较PCA3作为诊断前列腺癌工具的有效性，有学者把PCA3在上述组织中的表达与其它敏感 的前列腺癌瘤标比较，如人端粒末端转移酶反转录酶基因（hTERTgene)，hTERT是通过端粒 末端转移酶的活性来表达的，端粒末端转移酶活性被认为是一个有前景的前列腺癌相关肿 瘤标记物，在90%以上的前列腺癌中发现高表达，在正常和良性前列腺增生组织中表达很 低或不表达。de Kok等通过分析11例正常前列腺、5例BHP和31例前列腺腺癌样本发现， PCA3和hTERT在前两种标本中含量都很少，PCA3(均值为1. 7,范围0~5. 2)和hTERT (均 值为174,范围0~593)，两者之间没有明显的差别。但在前列腺腺癌中，PCA3(334~ 39465、均值为 5849, p <0· 0001)和 hTERT (0· 7 ~76. 1、均值为 10. 1，P <0· 0001)均有显 著的统计学意义。与良性组织相比，前列腺腺癌细胞中PCA3的含量增加了 34倍，而hTERT 仅为6倍。即使组织中前列腺癌细胞的含量少10%)，PCA3的表达量也明显高于正常或 者增生的前列腺组织。在白细胞中无 PCA3表达，但是能检测到hTERT mRNA，表明如果通过 血液、尿液、前列腺按摩液或者精液，hTERT mRNA可能导致假阳性，而PCA3mRNA却能检测出 进入这些体液的少量癌细胞。没有发现PCA3的表达与前列腺癌的临床分期及病理分级有 相关性。通过接收机运行曲线（Receiver operating curve R0C)分析，曲线下面积（Area under the curve AUC)代表其诊断效率。PCA3的AUC-ROC为0· 98 (95%可信区间0· 96~ 1. 00)，而hTERT的AUC-ROC为0. 88 (95%可信区间0. 78~0. 97)，表明PCA3诊断前列腺癌 的特异性和敏感性要好于hTERT。
[0005] PCA3基因是一种非编码基因，在检测方面，无法使用以蛋白或抗体为基础的检测 方法。RISH法、RT-PCR技术可在前列腺组织穿刺细胞学活检和体液（如血液、精液、尿液和 前列腺按摩液）检测中应用。
[0006] ACPP mRNA在前列腺中的高表达，是一个前列腺特异基因，是前列腺癌RT-PCR检 测中理想的内参.与PSA mRNA内参的相比，以他们有相似的前列腺的应用，在前列腺中的 表达比其他组织高1000倍以上，而ACPP在人群中表达的个体差异不明显。
[0007] 但是，与正常前列腺组织相比，PSA在前列腺癌中的表达升高两倍（p，0. 01);而 ACPP的表达没有变化。
[0008] 前列腺癌（PCa)为老年性疾病，具有病因复杂、发病部位隐蔽、潜伏期长且病理表 现多样等特点，是欧美国家男性泌尿生殖道最常见的恶性肿瘤之一，发病率在美国男性 肿瘤中占第二位，约占男性肿瘤的17%，死亡率占第二位。2003年美国新发现前列腺癌患 者220900人，死亡28900人。迄今为止，我国前列腺癌发病率虽远低于欧美发达国家，但 其增长较为迅速。由于我国人口老龄化、饮食结构的改变以及诊断技术的不断提高，前列 腺癌的发病率在不断上升。顾方六等以北京大学泌尿外科研究所建所前后50年间泌尿外 科共收治住院病人为研究对象，发现80年代后前列腺癌在泌尿系肿瘤中所占比例呈直线 上升趋势，由3. 3%上升至13. 4%。全国的发病率已由50年代的0.2/10万升至90年代的 1. 2-3. 4/10万，依据2012年中国肿瘤登记年报显示，前列腺癌为中国男性癌症发病率的第 6位，中国逻辑性癌症死亡率的第9位，虽然与欧美国家的102/10万相比要低得多，但也有 逐年增高的趋势。因此前列腺癌的早期诊断有重要的临床意义。
[0009] 早期前列腺癌可以通过前列腺癌根治手术或者放疗获得治愈，如果肿瘤发生了远 处转移或者局部临近器官的侵犯，临床治疗效果较差。我国前列腺癌患者在确诊时往往处 于进展期，抗雄性激素治疗虽然在一定范围内可以抑制肿瘤进展，但终究不能根治，该类前 列腺癌患者预后往往较差。目前的临床检查方法也不能判断前列腺癌患者的病情是将保持 稳定还是将进展为威胁患者生命的侵袭性前列腺癌。目前临床上把PSA (前列腺特异抗原） 作为筛选前列腺癌的首选标记物，PSA具有前列腺组织特异性，无前列腺癌特异性，前列腺 增生、前列腺炎、急性尿储留、前列腺的各种手术操作和有关前列腺的各种检查（如DRE)， 即使仅有很轻微的损伤，均可引起血清PSA水平的升高，导致诊断的特异性降低，临床使用 其筛选前列腺癌时常常导致不必要的前列腺穿刺。因此，寻找早期发现前列腺癌的肿瘤标 记物成为降低前列腺癌死亡率的关键。目前在前列腺癌肿瘤标志物的研究方面已经取得了 很大的进展，发现了一些前列腺癌特异的基因或者抗原，PSM已被广泛地运用于前列腺癌 的临床诊断和治疗中。近年来发现的人血管舒缓素激肤释放酶2〇1111]^111^1111〇^;[11-2)和 前列腺干细胞抗原（PSCA)也被证实为前列腺癌特异性基因，但它们并不能提高前列腺癌 的早期诊断率。基因 DD3mRNA (即为PCA3mRNA)高度表达于前列腺癌细胞中（> 95%)，对 于前列腺癌诊断的敏感性和特异性大于90%，作为早期诊断、判断预后的肿瘤标志物，显示 出良好的应用前景。
[0010] 从国内外研究成果来看，PCA3mRNA对前列腺癌的诊断灵敏度与特异性均好PSA， 将替代PSA检测成为前列腺癌一线诊断试剂，其主要用途有：
[0011] 1)临床前列腺癌的早期筛查与诊断；
[0012] 2)前列腺疾病人群的前列腺癌的排除诊断；
[0013] 3)前列腺癌病人预后诊断与疗效评价；
[0014] 4)男性人群的健康体检筛查。
【发明内容】
[0015] 本发明提出一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒，解决了现 有技术中对前列腺癌的诊断灵敏度与特异性差的问题。
[0016] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0017] 一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物，包括如下序列：
[0018] ACPPmRNA基因的引物设计与合成：参照Genebank提供的ACPPmRNA基因序列，应 用Genamic expression软件设计5'端及3'端引物：
[0019] 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 '
[0020] 下游引物：5 ' -TATATACTCTCCAAGTTCATA-3 '。
[0021] 一种 PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR 检测试剂盒，包括：
[0022] ACPPmRNA基因的引物设计与合成：
[0023] 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 '
[0024] 下游引物：5 ' -TATATACTCTCCAAGTTCATA-3 ' ；以及
[0025] PCA3mRNA基因的引物设计与合成：参照Genebank提供的PCA3mRNA序列，应用 Genamic expression软件设计5'端及3'端引物；共设计2对引物