；
[0026] 第1对引物设计如下：
[0027] 上游引物：5' -TGGGAAGGACCTGATGATACA-3' ；
[0028] 下游引物：5' -CCCAGGGATCTCTGTGCTT-3'，扩增产物为 220bp ;
[0029] 第2对引物设计如下：
[0030] 上游引物：5'-TGGCAGGGGTGAGAAATAAG-3' ；
[0031] 下游引物：5' -TGCTTCCTTTTGTGCTTCCT-3'，扩增产物为 186bp。
[0032] 作为优选的技术方案，所述检测试剂盒包括RT-PCR反应液、MMLV RT/Hot start Taq Mix、阳性对照以及阴性对照。
[0033] 作为优选的技术方案，所述试剂盒中各组分的量为RT-PCR反应液：200ul ;MMLV RT/Hot start Taq Mix :20ul ;阳性对照（cDNA) :20ul ;阴性对照（cDNA) :20ul。
[0034] 作为优选的技术方案，所述RT-PCR反应液的组成如下，10 X RT-PCR Buf fer : 20.0 ul ;25mM MgCl2 :16. Oul ;10mM dNTP :4. Oul ;ACPPmRNA5'端引物：2. Oul ;ACPPmRNA3'端 引物：2. Oul ;PCA3mRNA5' 端引物：2. Oul ;PCA3mRNA3' 端引物：2. Oul ;ddH20 :152ul。
[0035] 有益效果
[0036] (1)本发明提供了一种前列腺特异基因 ACPP mRNA定量检测新方法，该方法可以 检测前列腺组织、前列腺按摩液、精液、血液、尿液(或尿液沉渣)等样本中的ACPP mRNA表达 量。由于前列腺组织细胞与前列腺癌细胞均有ACPPmRNA的高表达，所以对ACPP mRNA的检 测，可以确定样本中是否含有列腺组织细胞与前列腺癌细胞和他们的含量。而基因 DD3mRNA (即为PCA3mRNA)高度表达于前列腺癌细胞中（> 95%)，可作为前列腺癌早期诊断、判断预 后的肿瘤标志物。PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒是以ACPP mRNA为内参的分子 诊断试剂，极大地提高了前列腺癌检测的灵敏度与特异性，诊断准确率更高。
[0037] (2) ACPP mRNA在前列腺中有很高的表达，并能够容易且可靠地检测出来；ACPP mRNA仅在前列腺上皮细胞中表达，特异性强；在正常前列腺上皮细胞与前列腺肿瘤细胞中 ACPP mRNA表达水平基本一致。
[0038] 利用ACPP mRNA作为前列腺癌PCA3mRNA RT-PCR检测内参十分理想，一方面可以 计算PCA3mRNA/ACPP mRNA比值，确认检测结果，判定前列腺癌；另一方面由于ACPP mNRA仅 在前列腺上皮细胞(或前列腺癌细胞)中表达，ACPPmRNA的检测结果可以判定组织细胞样本 取样是否成功，进而判定实验是否成功。增加检测结果的可信度。
[0039] (3)利用本发明制备的PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，是一项创新的组 合，优于PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR组合检测试剂盒，其检测灵敏度提高至90%以上。
【附图说明】
[0040] 为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅 是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提 下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0041] 图1为本发明实施例1 =ACPPmRNA RT-PCR检测灵敏度实验结果电泳图；
[0042] 图2为本发明实施例2 :PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测灵敏度实验结果电泳 图。
【具体实施方式】
[0043] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0044] 实施例1
[0045] ACPPmRNA RT-PCR 检测
[0046] I. ACPPmRNA基因引物设计与合成：参照Genebank提供的ACPPmRNA基因序列，应 用Genamic expression软件设计5'端及3'端引物：
[0047] 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 '
[0048] 下游引物：5 ' -TATATACTCTCCAAGTTCATA-3 '
[0049] 经过生物信息学分析、BLAST检索，以上引物均有高度特异性100%，未发现有同源 序列，是非常好的引物.
[0050] 2. LNCaP细胞培养与应用：LNCaP细胞为人前列腺癌细胞，可以高表达ACPPmRNA， 可以利用该细胞研究RT-PCR反应条件与进行相关实验。
[0051] LNCaP细胞的复苏：水浴箱先升温至37°C，取出冻存管置入水浴（37°C )中摇动 至融化，至悬液状。75%酒精消毒冻存管口，用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并滴加10倍 以上的培养液，混合后离心1000gX5min，去上清。用培养液适当稀释后，接种培养瓶，置于 37°C 5%C02孵箱中静置培养。LNCaP细胞贴壁需24-36h，第3天更换培养液一次，期间勿频 繁拿放观察，以免影响细胞贴壁。
[0052] 更换培养液步骤：用吸管吸出旧培养液或倒出，后用Hanks液（pH7. 0-7. 2)洗1-2 遍，再加入数毫升新培养液（PH7. 0-7. 2)置CO2孵箱培养。
[0053] 传代步骤：经过1周左右换液，培养瓶中LNCaP细胞生长状态良好，已覆盖80%瓶 底，细胞形态呈单层、多角形且彼此粘连时可传代。
[0054] (1)吸取或倒掉瓶内旧培养液；
[0055] (2)加入1ml左右（150ml培养瓶）0. 25%胰蛋白酶，轻摇培养瓶，使消化液浸润所 有细胞表面；
[0056] (3)消化液最好在370C (胰酶作用最适温度），放入C02孵箱，消化2-5min后把培 养瓶置于显微镜下观察，见细胞回缩、细胞间隙增大时，立即终止消化；
[0057] (4)可使用含10%血清培养液或血清终止消化，轻拍瓶底，镜下可见大量细胞在悬 液中，少量贴壁，可用弯头吸管，吸取培养液，反复按顺序轻柔吹打瓶底细胞；
[0058] (5)细胞计数或直接将细胞悬液等分两瓶，并再加入少许新培养液，置C02孵箱 中。
[0059] LNCaP细胞的收集：对大多数细胞株来说，一个直径90mm培养皿中，培养细胞的总 RNA 回收率 100-200ug(mRNA 约为 l-2ug)。
[0060] (1)取生长旺盛（对数生长期细胞）占瓶底90%以上，去旧培养液加入胰酶消化 (同前）；（2)细胞悬液（计数5X10 6)离心后去上清；
[0061] (3)加入数毫升0· 9%生理盐水重悬细胞，移入Eppendorf管中，离心后去上清（消 除胰酶对实验的影响）。Eppendorf管封管后置液氮瓶中保存备用。
[0062] 3. mRNA的高效提取
[0063] 经典的总RNA提取方法，适用于组织样本(前列腺组织)、前列按摩液、精液及细胞 培养物等样本。
[0064] (1)样品裂解：LNCaP细胞培养瓶（细胞数约5X106)加 TRIzol800ul，立即混匀， 抽打裂解酶5-10次，室温5min静置。
[0065] (2)加入200ul氯仿，用力颠倒混匀10S，室温静置5min。
[0066] (3)高速离心 1000 Og X15min，4°C。
[0067] (4)移上层水相到I. 5ml管内，加入500ul异丙醇振荡混匀。室温静置10min，4°C 离心 1000 Og XlOmin
[0068] (5)去上清，用 75% 乙醇 lml, 4°C离心 7500gX5min。
[0069] (6)晾干乙醇，室温倒置5-15min，使RNA沉淀，恰好干燥。
[0070] (7)溶解 RNA，加入 0· 1%DEPC 水 50ul。
[0071] (8) 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0072] 4.逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR):
[0073] (1)逆转录反应：在PCR反应管中加入下列成分（按IOul反应体积计算）
[0074]
【主权项】
1. 一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物，包括如下序列： ACPPmRNA基因的引物设计与合成： 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 ' 下游引物：5' -TATATACTCTCCAAGITCATA-3'。
2. -种 PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR 检测试剂盒，包括： ACPPmRNA基因的引物设计与合成： 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 ' 下游引物：5' -TATATACTCTCCAAGITCATA-3' ；以及 PCA3mRNA基因的引物设计与合成：共设计2对引物； 第1对引物设计如下： 上游引物：5 ' -TGGGAAGGACCTGATGATACA-3' ； 下游引物：5' -CCCAGGGATCTCTGTGCTT-3'，扩增产物为 220bp ; 第2对引物设计如下： 上游引物：5'-TGGCAGGGGTGAGAAATAAG-3' ； 下游引物：5'-TGCTTCCITTTGTGCTTCCT-3'，扩增产物为 186bp。
3. 根据权利要求2所述的一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述检测试剂盒包括RT-PCR反应液、MMLV RT/Hot start Taq Mix、阳性对照以及阴性对 照。
4. 根据权利要求3所述的一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒中各组分的量为RT-PCR反应液：200ul ;MMLV RT/Hot start Taq Mix :20ul ;阳 性对照（cDNA) : 20uI ;阴性对照（cDNA) : 20uI。
5. 根据权利要求3所述的一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述 RT-PCR 反应液的组成如下，10XRT-PCR Buffer :20.0 ul ;25mM MgCl2 :16. Oul ;10mM dNTP :4. Oul ;ACPPmRNA5' 端引物：2. Oul ;ACPPmRNA3' 端引物：2. Oul ;PCA3mRNA5' 端引物： 2. Oul ;PCA3mRNA3' 端引物：2. Oul ;ddH20 :152ul。
【专利摘要】本发明提出了一种PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒，其检测引物，包括如下序列：ACPPmRNA基因的引物设计与合成：上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’。检测试剂盒，包括：包括RT-PCR反应液、MMLV RT/Hot start Taq Mix、阳性对照以及阴性对照。利用本发明制备的PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，优于PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR组合检测试剂盒，其检测灵敏度提高至90%以上。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104878077
【申请号】CN201410071895
【发明人】谭巍, 史镜宇, 王广银, 黄云坚, 马小伟
【申请人】谭巍
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2014年2月28日