一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，更具体的涉及一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗 炎药物筛选模型的构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒感染严重威胁着人类健康，给社会带来严重的经济损失。1918年流感大 流行，全世界范围内约有5亿人感染，导致5000万~1亿人死亡。2009年爆发的猪流感波 及200多个国家，导致约18000人死亡。2013年，出现在中国的高致病性禽流感H7N9再次 引起人们对流感病毒及如何控制流感的关注。除了流感大爆发外，每年的季节性流感也给 社会带来很大的损失，在全球范围内约25万人~50万人死于流感。目前，流感的主要治疗 策略是抗病毒药物治疗。现在全世界广泛使用的抗流感病毒药物只有两种：一种是M2离子 通道抑制剂，如金刚烷胺和金刚乙胺；一种是神经氨酸酶抑制剂，如奥司他韦和扎那米韦。 金刚烷胺耐药性已经广泛存在，奥司他韦也开始出现部分毒株耐药。因此开发新型抗流感 病毒药物是十分必须的。
[0003] 目前研宄认为，流感病毒感染后过强的炎症反应是导致病人呼吸衰竭，进而死亡 的主要原因。炎症因子是炎症反应的重要效应分子。这类炎症因子包括：TNF-、MCP-1、IL-I、 IL-6、RANTES、IL-10、MIP-3、IL-8以及IP-10等。但是这些因子在这些病毒感染引发炎症 中的作用机理都不十分清楚。近几年，有关抗炎药物应用于流感病毒治疗的研宄不断增多， 新型抗炎药物的发现可能给流感治疗提供新的策略。
[0004] 抗流感病毒及抗炎药物的筛选和评价模型以往使用的是细胞模型和动物模型。动 物模型中，动物使用量，昂贵的化学药物都使得经济开销大。此外，对于病毒感染的动物模 型，还需要特殊的安全措施，如生物安全二级或者更高实验室。而细胞模型中由于离体的单 细胞失去其所在的组织环境，因此不能较好地模拟它在体内的相关功能，评价不准确。在细 胞上有效的药物往往不能在动物体内发挥相应的效果。虽然有人用活体组织切片进行毒理 的研宄，但目前尚未有利用活体组织切片培养进行药物筛选的相关研宄。另外，虽然有报道 流感可以在猪肺片复制，但是没有到把它发展为药物评价模型。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于活体肺切 片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建方法及其应用，其目的在于构建一种利用活体 肺切片进行抗流感病毒或抗炎药物筛选的模型，而快速有效的对抗流感病毒或抗炎药物进 行筛选。
[0006] 按照本发明的一个方面，提供了一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛 选模型，其特征在于，包括以下步骤：先将病毒感染活体肺切片，再将待检测药物作用于感 染了病毒的所述肺切片，最后通过检测相关细胞因子的变化来验证所述待检测药物的效 果。
[0007] 本发明还提供了一种药物筛选模型的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：
[0008] (1)肺切片的制备：
[0009] 利用活体鼠肺制备得到不同厚度规格的肺切片样本，以不同编号分别标记，并且 所述厚度规格控制为微米量级；
[0010] ⑵肺切片的厚度优选：
[0011] 利用步骤（1)所得到的多个肺切片样本，流感病毒感染后执行冲洗，添加新鲜培 养液，并在12小时~72小时之后采集肺切片样本的培养基上清；然后，根据所述培养基上 清中的病毒滴度以及肺切片的厚度规格，选择225 ym~275 ym的样本作为厚度优选后的 肺切片样本备用；
[0012] (3)神经氨酸酶活性与病毒滴度相关性评价：
[0013] 利用步骤（2)中厚度优选后的肺切片样本，执行流感病毒的感染，并测试感染所 引发的病毒滴度变化以及相应神经氨酸酶的活性变化，由此确认神经氨酸酶的活性与流感 病毒滴度在肺切片样本上具有相关性；
[0014] (4)炎症因子的选择：
[0015] 用流感病毒感染活体小鼠，1天~7天后检测小鼠体内的多种炎症因子水平；此 外，同样利用步骤（2)中厚度优选后的肺切片样本，执行流感病毒的感染，利用肺切片样本 上清检测体外的多种炎症因子水平；接着，根据所述多种炎症因子的体内外相关系数，选择 炎症因子IP-10、RANTES和ΜΙΡ-3α作为评价抗炎药物的指标，同时结合步骤（3)所确认的 神经氨酸酶活性，由此一共完成对所述抗流感病毒药物筛选模型的构建过程。
[0016] 优选地，对于步骤（1)而言，所述肺切片的具体制备过程如下：
[0017] (1)将小鼠处死并消毒。分离小鼠气管，将预热至37°C的低熔点凝胶从气管注射 到小鼠肺部，直至肺部充盈到标准大小；
[0018] (2)整只小鼠放置在冰上至低熔点凝胶初步凝固，剪断小鼠气管，小心取出小鼠的 心脏和整个肺脏，并将之放入预冷至4°C的培养基，直至低熔点凝胶完全凝固；分离小鼠的 心脏和肺脏，选用左肺叶；在肺脏的支气管尾端的肺部做一个横切面，然后在肺部另一端距 该切面0. 8cm处做另一个横切面，取中间0. 8cm的肺块备用；
[0019] (3)将步骤⑵制备所得的肺块固定在切片机标本托盘上，并放入预冷至4°C的培 养基中，按照切片机设定的厚度执行切片操作，得到未清洗的肺切片；将所述未清洗的肺切 片置于48孔细胞培养板中并加入培养基，每小时更换培养基并重复3次~5次，以清洗切 片过程导致的细胞碎片，最后制备得到所需的肺切片。
[0020] 优选地，对于步骤（3)而言，所述评价方法的具体步骤包括：
[0021] (1)用200 μ I IO5PFUAiI的流感病毒感染肺切片样本。2小时后，弃病毒液，磷酸 缓冲液冲洗肺切片样本两次后，添加新鲜培养液至肺切片样本中；
[0022] (2)在12小时~120小时之间，每间隔一断时间采集步骤（1)得到的肺切片样本 上清液；
[0023] (3)采用组织半数感染量（TCID5tl)检测步骤（2)采集得到的上清液的病毒滴度， 结果显示，病毒在48小时后达到复制高峰，并进入稳定复制阶段；
[0024] (4)取步骤（2)采集得到的上清液40 μ 1并加入20 μ M的MUNANA20 μ 1进行反应， 在96孔黑色optiplate板中37°C孵育2小时；终止反应，然后检测上清液与MUNANA反应 后的荧光强度；结果显示，荧光强度在48小时后到达高峰，此变化趋势和组织半数感染量 的变化趋势相同；由于MUNANA是神经氨酸酶的特异性荧光底物，可用来指示神经氨酸酶的 活性，结合荧光强度和步骤（3)中组织半数感染量的变化趋势，提示神经氨酸酶活性可以 代表流感病毒在肺切片样本上的复制情况。
[0025] 优选地，步骤（4)中炎症因子的选择方法具体步骤包括：
[0026] (1)小鼠经腹腔注射麻醉后，鼻腔感染HlNl病毒。感染后1、3、5天分别收集肺洗 液，并以未感染的小鼠肺洗液为阴性对照；检测体内不同炎症因子的水平，所述不同炎症因 子分别为：TNF-a、IL-6、IL-10、IL-I β、IFN-γ、ΜΙΡ-3 α、IP-10 和 RANTES ;检测结果显示 第3天的炎症因子水平与阴性对照组差别最为显著，所以选择第3天的炎症因子水平作为 体内炎症因子水平与体外炎症因子水平相比较；
[0027] (2) 200 μ L IO5PFUAiI的HlNl病毒感染肺切片样本，并以未感染病毒的所述肺切 片样本作为阴性对照；2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗两次后，添加新鲜培养液；分别在 24小时以及48小时后收集上清并检测与步骤（1)中相对应的所述不同炎症因子的水平，检 测结果为体外炎症因子水平；
[0028] (4)采用Gragh Pad 5. 0的线性相关模型分析体内炎症因子水平和体外炎症因子 水平的相关性，根据体内外相关系数，最后选择炎症因子IP-l〇、RANTES和ΜΙΡ-3α作为在肺 切片上评价抗炎药物的指标。
[0029] 优选地，在步骤（4)之后，还可以执行筛选模型的验证，其具体步骤包括：
[0030] (1)用流感病毒感染肺切片样本，2小时后弃去病毒液并用磷酸缓冲液冲洗2次~ 4次，得到感染后的肺切片样本；