b所示，病毒在48h达到复制高峰， 并进入稳定复制阶段。
[0070] (4)2' -(4-甲基伞形酮）-a -D-乙酰神经氨酸（MUNANA)是神经氨酸酶（NA)的 特异性荧光底物，用于表现神经氨酸酶的活性。将步骤（2)采集所得的病毒上清40μ1和 20 μΜ的MUNANA 20 μ 1放人96孔黑色optiplate板。37°CfP?育2小时后，加100 μ 1终止 液（0. 14M氢氧化钠溶于83%酒精）终止反应。然后用Wallac Envision多标记读板机读 板（激发光355nm，发射光485nm)。结果如图3a和3b所示，荧光强度在48小时到达高峰， 此变化趋势和图2相同，提示神经氨酸酶活性可以代表流感病毒在切片上的复制情况。
[0071] 实施例4炎症因子的选择
[0072] ⑴小鼠经腹腔注射戊巴比妥（75mg/kg)麻醉后，经鼻腔滴20 μ I 105PFU/ml HlNl 病毒（PR8)。分别在病毒感染后1、3、5天收集肺洗液，以未感染的小鼠肺洗液为阴性对 照。剖开小鼠胸腔，分离气管，并托出肺脏后，用2mL含有0.1%牛血清白蛋白（BSA)的磷 酸缓冲液通过气管灌洗3次后，收集肺洗液，并检测细胞因子TNF- a，IL-6, IL-10, IL-I β， IFN-γ，ΜΙΡ-3 α，IP-IO和RANTES (检测所用的ELISA试剂盒购自武汉博士德），结果如图 4所示，流感病毒感染小鼠后炎症因子发生变化。结果显示流感病毒感染小鼠后第3天的炎 症因子分泌，相比较对照组变化最为显著（8个因子中7个显著上升），而第5天，个别因子 开始下降。所以选择第3天的炎症因子水平进行体内体外比较。
[0073] (2)200 μ L IO5PFUAiI的HlNl病毒感染实施例1制备所得的肺切片样本2,并以 未感染病毒的上述肺切片作为阴性对照。感染2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗两次后， 添加新鲜培养液。分别在24小时以及48小时后收集上清并检测细胞因子TNF-a，IL-6， IL-1O，IL_10 ,IFN-γ，ΜΙΡ_3α，ΙΡ-1〇 和 RANTES，结果如图 5 所示。图 5a、5b 为感染后 24 小时后的细胞因子变化，除了 IL-I β和IL-10外，其他因子都显著上升。其中IFN-Y的水 平超出了试剂盒的检测低限。TNF-α，ΜΙΡ-3α，IL-6, RANTES和ΙΡ-10的上升倍数分别是 2. 1、3. 3、2. 4、1.7以及8. 9。图5c、5d为感染后48小时后的细胞因子变化，可以看出，上述 因子的上升倍数高于感染后24小时更高，分别是4、4. 4、3、4以及19。
[0074] (4)将流感病毒诱导后的炎症因子水平减去其相应的对照组水平，采用Gragh Pad 5. 0的线性相关模型分析体内（肺洗液）和体外（切片上清）的炎症因子水平的相关性。 结果显示，感染后24小时切片上清中的炎症因子含量和小鼠肺洗液中的炎症因子含量呈 显著正相关，相关系数为0. 75,如图6a。感染后48小时切片上清中的炎症因子含量和小鼠 肺洗液中的炎症因子含量也呈显著正相关，相关系数为0.61，如图6b。其中IP-10，RANTES 和ΜΙΡ-3α体内体外的相关性较好，因此它们可作为在肺切片上评价抗炎药物的指标。
[0075] 实施例5筛选模型的验证
[0076] (1) 200 μ L 105PFU/ml的的HlNl病毒或者Η3Ν2病毒感染实施例1制备所得的肺 切片样本2。
[0077] (2)感染2小时后，弃病毒液，磷酸缓冲液洗两次后，添加含有表1中各种药物的新 鲜培养基各200 μ L。
[0078] (3)48小时后分别收集上清并检测神经氨酸酶活性和IP-10水平，结果汇总见表 1 ：
[0079] 表 1
[0080]
【主权项】
1. 一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型，其特征在于，包括以下步 骤：先将病毒感染活体肺切片，再将待检测药物作用于感染了病毒的所述活体肺切片，最后 通过检测病毒滴度和相关细胞因子的变化来验证所述待检测药物的效果。
2. 如权利要求1所述的基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型，其构建的 具体步骤包括： (1) 肺切片的制备： 利用活体鼠肺制备得到不同厚度规格的肺切片样本，以不同编号分别标记，并且所述 厚度规格控制为微米量级； (2) 肺切片的厚度优选： 利用步骤（1)所得到的多个肺切片样本，流感病毒感染后执行冲洗，添加新鲜培养液， 并在12小时~72小时之后采集肺切片样本的培养基上清；然后，根据所述培养基上清中的 病毒滴度以及肺切片的厚度规格，选择225 ym~275 ym的样本作为厚度优选后的肺切片 样本备用； (3) 神经氨酸酶活性与病毒活性相关性评价： 利用步骤（2)中厚度优选后的肺切片样本，执行流感病毒的感染，并测试感染所引发 的病毒滴度变化以及相应神经氨酸酶的活性变化，由此确认神经氨酸酶的活性与流感病毒 滴度在肺切片样本上具有相关性； (4) 炎症因子的选择： 用流感病毒感染活体小鼠，1天~7天后检测小鼠体内的多种炎症因子水平；此外，同 样利用步骤（2)中厚度优选后的肺切片样本，执行流感病毒的感染，利用肺切片样本上清 检测体外的多种炎症因子水平；接着，根据所述多种炎症因子的体内外相关系数，最终选择 炎症因子MIP-3a、RANTES或IP-IO作为评价抗炎药物的指标，同时结合步骤（3)所确认的 神经氨酸酶活性，由此一共完成对所述抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建过程。
3. 如权利要求2所述的基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建方 法，对于步骤（1)而言，所述肺切片的具体制备过程如下： (1) 将小鼠处死并消毒。分离小鼠气管，将预热至37°C的低熔点凝胶从气管注射到小 鼠肺部，直至肺部充盈到标准大小； (2) 整只小鼠放置在冰上至低熔点凝胶初步凝固，剪断小鼠气管，小心取出小鼠的心脏 和整个肺脏，并将之放入预冷至4°C的培养基，直至低熔点凝胶完全凝固；分离小鼠的心脏 和肺脏，选用左肺叶；在肺脏的支气管尾端的肺部做一个横切面，然后在肺部另一端距该切 面0. 8cm处做另一个横切面，取中间的肺块备用； (3) 将步骤（2)制备所得的肺块固定在切片机标本托盘上，并放入预冷至4°C的培养基 中，按照切片机设定的厚度执行切片操作，得到未清洗的肺切片；将所述未清洗的肺切片置 于细胞培养板中并加入培养基，每小时更换培养基并重复3次~5次，以清洗切片过程导致 的细胞碎片，最后制备得到所需的肺切片。
4. 基于权利要求2所构建的基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型，其具 体步骤包括： (1)用流感病毒感染肺切片样本，1小时~4小时后弃去病毒液并用磷酸缓冲液冲洗2 次~4次，得到感染后的肺切片样本； (2) 将含有待检测药物的培养基，加入步骤（1)中感染后的肺切片样本，得到药物作用 的肺切片样本； (3) 将步骤（2)中加入培养基的肺切片培养12小时~120小时后，通过检测培养基上 清中病毒滴度以及相关炎症因子的变化水平，以确定药物的抗病毒或抗炎效果。
5.如权利要求4所述的基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型，其特征在 于，步骤（3)中的炎症因子包括：MIP-3a、RANTES或IP-10。
【专利摘要】本发明公开了一种基于活体肺切片的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型，其特征在于，包括以下步骤：先将病毒感染活体肺切片，再将待检测药物作用于感染了病毒的所述活体肺切片，最后通过检测病毒滴度和相关细胞因子的变化来验证所述待检测药物的效果。本发明还公开了一种该筛选模型的构建方法，该方法包括：肺切片的制备、肺切片的厚度优选、神经氨酸酶活性与病毒滴度相关性评价以及炎症因子的选择。通过该发明，构建了一种基于活体肺切片的药物筛选方法，比传统的细胞模型更加符合真实的机体情况，准确有效。
【IPC分类】G01N33-68, C12Q1-44
【公开号】CN104878074
【申请号】CN201510290275
【发明人】陈绪林, 刘锐
【申请人】中国科学院武汉病毒研究所
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月29日