基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法

基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种基因工程领域的基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物进行PCR扩增得到编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得木质素过氧化物酶过表达重组菌株。本发明通过构建外源表达载体，优化蛋白诱导表达的条件和融合标签等方法，实现了木质素过氧化物酶的胞外过表达。
CGMCC NO.5706
2012.01.09
【专利说明】基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰 略红链霉菌的基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法。

【背景技术】
[0002] 木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5 -羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种 复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有联结强化细胞的作用。此外， 木质素也是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的 亲和力。
[0003] 根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成 的紫丁香基木质素 （S -木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素 (G -木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素 （H -木质 素）。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素（G)，双子叶植物主要 含愈创木基-紫丁香基木质素 （G - S)，单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯 基木质素 （G - S - H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束 细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚 合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于 纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和 抵抗不良外界环境的侵袭。
[0004] 木质素单体同时含有多种活性官能团，如羟基、羰基、羧基、甲基及其它侧链结构。 其中羟基在木质素中存在较多，以醇羟基和酚羟基两种形式存在，而酚羟基的多少又直接 直接影响木质素的物理和化学结构，如能反映出木质素的醚化和缩合程度，同时也能衡量 木质素的溶解性能和反应能力；在木质素的侧链上，有对羟基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、 对羟基肉桂酸、阿魏酸等酯型结构存在，这些酯型结构存在于侧链的α位或 Y位。在侧链 α位除了酯型结构外，还有醚型连接或作为联苯结构的碳-碳联结。同酚羟基一样，木质素 的侧链结构也直接关系它的化学特性。
[0005] 由于木质素的复杂结构、高分子量及高度疏水性，与纤维素与半纤维素相比，木质 素的降解相对缓慢。已发现木质素降解酶主要有3类：漆酶（Laccase)、木质素过氧化物酶 (Manganese peroxidase)和木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase)。
[0006] 灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)作为一种广泛存在于土壤的细菌， 具有很强的木质素降解能力并得到了研究者越来越多的关注。明确灰略红链霉菌降解木质 素的分子机制，克隆并表达关键木质素降解酶，对于开发新型木质素降解酶制剂进而实现 木质素乃至木质纤维素的快速降解具有重要意义。
[0007] 经过对现有技术的检索发现：中国专利文献号CN103205403A公开（公告）日 2013.07. 17,公开了一种生产降解木质素酶的方法。该技术首先分别从微生物中克隆木质 素过氧化物酶，锰过氧化物酶和漆酶基因；构建含上述三种基因表达框架的毕赤酵母表达 载体和酿酒酵母表达载体，并将载体转化相应的宿主菌而获得工程菌。分别发酵毕赤酵母 工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶和漆酶。但该技术中 的木质素过氧化物酶克隆自白腐真菌，真菌来源木质素过氧化酶对环境因素敏感，在高温 和高pH下难以维持较高的生物学稳定性。
[0008] 中国专利文献号CN102703344A公开（公告）日2012. 10. 03,公开了一株秸杆降解 放线菌及其应用，但该技术中涉及的木质素过氧化物酶在灰略红链霉菌内为表达酶，为诱 导酶且表达量较低，难以满足生产需求。


【发明内容】

[0009] 本发明针对现有技术存在的由于木质素过氧化物酶在生物体内多为胞内酶且表 达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于木质素过氧化物酶的工程 菌及其实现方法，通过构建外源表达载体，优化蛋白诱导表达的条件和融合标签等方法，实 现了木质素过氧化物酶的胞外过表达。
[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0011] 本发明涉及一种木质素过氧化物酶的工程菌，该工程菌为外源表达木质素过氧化 物酶的大肠杆菌。
[0012] 所述的胞内木质素过氧化物酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1木质素过氧化物酶基因 SG - LIP,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，编码该木质素过氧化物酶核苷酸序列为1278bp，共编 码425个氨基酸。
[0013] 所述的 SEQ ID NO. 1 克隆自灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD-1, 现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所邮编100101。
[0014] 所述的木质素过氧化物酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获 得。
[0015] 本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有 酶切位点和谷胱甘肽的引物进行PCR扩增得到编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列；然后 将扩增得到的基因序列连接到表达载体PET - 41a(+)，再将获得的连接产物转入大肠杆菌 表达菌株内，获得木质素过氧化物酶过表达重组菌株。
[0016] 所述的含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物，即含有Spe I和EcoR I酶切位点引 物，具体包括：
[0017] Lip - Spe I - F:GACTAGTATGGCTGACCCTTCCCTGTCGCA
[0018] Lip - EcoR I - R:GGAATTCTCACCCCTCCAGCAGCGCCTGAC
[0019] 所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个 循环后68°C终延伸3min。
[0020] 所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0021] 本发明涉及一种木质素过氧化物酶的工程菌的应用，将其用于木质素过氧化物酶 的体外高效表达，并用于木质素过氧化物酶的规模化发酵生产。 技术效果
[0022] 与现有技术相比，本发明克服现有技术中的木质素过氧化物酶在生物体内多为胞 内酶且表达量较低，导致应用范围和效果严重受限等不足，应用基因工程手段实现其体外 的大量表达与合成。此外，本发明通过在重组蛋白N端添加谷胱甘肽标签的方法，在显著提 高表达量的同时也方便了蛋白后期的纯化，为木质素过氧化物酶的规模化发酵生产提供一 种新的方向。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1为灰略红链霉菌木质素过氧化物酶信号肽预测图。
[0024] 图2为重组木质素过氧化酶（GST · Tag)体外过表达SDS - PAGE验证图。
[0025] 图3为重组木质素过氧化酶（GST · Tag)体外过表达Western Bolt验证图。

【具体实施方式】
[0026] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0027] 本实施例包括以下步骤：
[0028] 步骤1)灰略红链霉菌的分离及培养
[0029] 灰略红链霉菌分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸杆，保藏编号为CGMCC No. 5706。 将该菌种接种于LB液体培养基，32 °C培养48h。
[0030] 上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCllO. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液体培养基中加入15. 0 - 20. 0g/L琼脂即得LB固体培养基。
[0031] 步骤2)灰略红链霉菌基因组DNA提取
[0032] 灰略红链霉菌基因组DNA提取
[0033] 收集2. OmL菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180 μ L溶 菌酶（20mg/mL)和 20 μ L EDTA 溶液（0· 5Μ, ρΗ8· 0)，37 °C 处理 45min，加入 4 μ L RNase A (100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN)操作 说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质 量，确保无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0034] 步骤3)灰略红链霉菌基因组测序
[0035] 确定全基因组鸟枪法（WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度 的文库，采用Illumina Miseq(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、 低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler v2. 8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0036] 步骤4)蛋白编码基因功能预测
[0037] 采用Glimmerf. 0软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训 练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。 然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为 llObp，其余参数为Glimmer3. 0的默认设置。
[0038] 步骤5)木质素过氧化物酶膜定位预测
[0039] 采用SignalP4. 1分别对木质素过氧化物酶氨基酸序列进行信号肽模拟预测，如 图1所示。结果表明木质素过氧化物酶不存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞内酶。
[0040] 步骤6)木质素过氧化物酶表达载体构建
[0041] 根据木质素过氧化物酶基因序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下：
[0042] Lip - Spe I - F:GACTAGTATGGCTGACCCTTCCCTGTCGCA
[0043] Lip - EcoR I - R:GGAATTCTCACCCCTCCAGCAGCGCCTGAC
[0044] 以灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组DNA为模板，用含有 Spe I和EcoR I酶切位点引物进行PCR扩增获得木质素过氧化物酶基因序列，使用DNA A-Tailing Kit 加 A 后连接到 T-Vector ?]\?11119-1'〇^1^1^)，并将连接产物转入0!15〇 大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。Spe I和EcoR I进行双酶切（37°C)，回 收木质素过氧化物酶DNA片段Lip。用相同内切酶酶切表达载体pET-41a(+)并回收载体 DNA片段。将Lip与载体片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接（16°C)，将连接产物 转入DH5 α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有重组表达质粒的阳 性克隆。挑取阳性克隆接种于含有卡那霉素（50yg/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37°C 培养16小时后提取质粒。
[0045] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个循环 后68°C终延伸3min。
[0046] 步骤7)木质素过氧化物酶过表达转基因菌株的构建
[0047] 将上述重组表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌，并在含有卡那霉素（50 μ g/ mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固体培养基上筛选，获得木质素过氧化物酶过表达菌株。
[0048] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：该菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大肠杆 菌缺乏的6种稀有密码子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)对应的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及链霉菌等高GC含量生物基因在原核系统中的表达水平。
[0049] 步骤8)重组木质素过氧化物酶体外过表达及纯化
[0050] 挑取阳性克隆于含有卡那霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB液体培养 基中，在32°C震荡培养，当0D6(?达到0. 8 - 1. 0时，28°C加入IPTG溶液使培养液IPTG浓度 达到100 μ M，继续培养12小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利 用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液缓冲液重悬菌体后 在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清，13000rpm/min离心15min收集上清，上清液即 为木质素过氧化物酶的粗酶液。通过0. 45 μ m滤膜过滤掉粗酶液中的杂质，随后通过GST 蛋白纯化试剂盒的操作要求完成融合蛋白的纯化。
[0051] 重组菌诱导表达木质素过氧化物酶的SDS - PAGE验证
[0052] 制备 12% SDS -PAGE 胶，将粗酶液与 5XSDS -PAGE Loading Buffer 比例混合，与 沸水浴5min，每个点样孔上样20 μ L，在160V电压下电泳60 - 70min，直至溴酚蓝指示条带 完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R - 250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直 至背景色完全脱去，条带清晰可见（如图2)。
[0053] 所述的12% SDS - PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为：
[0054] 分离胶：蒸馏水 1. 6mL，30%丙烯酰胺溶液 2. OmL，1· 5M Tris - HC1 (ρΗ8· 8) 1. 3mL， 10% 过硫酸铵（APS)O. 05mL，10% SDS 溶液 0· 05mL，TEMEDO. 002mL ;
[0055] 浓缩胶：蒸馏水0.68mL，30 %丙烯酰胺溶液0. 17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL，10 % 过硫酸铵（APS)0.01mL，10 % SDS 溶液 O.OlmL， TEMEDO. OOlmL ；
[0056] 所述的 5X SDS - PAGE Loading Buffer 组分为：1M Tris - HC1 (pH6. 8) 1. 25mL， SDSO. 5g，溴酚蓝25mg，甘油2. 5mL，去离子水定容至5mL。小份分装（500 μ L)后与室温保 存，使用前每小份加入β -巯基乙醇25 μ L。
[0057] 所述的考马斯亮蓝R - 250溶液组分为：考马斯亮蓝R - 250 lg，异丙醇250mL，冰 醋酸100mL，去离子水650mL ;所述的脱色液组分为：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，去离子 水 850mL。
[0058] 重组菌诱导表达木质素过氧化物酶的Western Blot验证
[0059] Western Blot详细步骤如下：
[0060] 按顺序组装转膜装置：正电极、海绵、三张滤纸、PVDF膜、SDS - PAGE胶、三张滤纸、 海绵和负电极。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，滤纸用电转液浸泡。将装好的转膜 装置放入电转槽，4°C 100V转60 - 70min。
[0061] 所述的SDS - PAGE胶是指：实施例9中已完成电泳、未染色的胶块；所述电转液的 组分为：甘氨酸2. 9g/L，Tris5. 8g/L，SDS0. 37g，甲醇200mL，去离子水800mL，配好之后4°C 预冷。
[0062] 封闭：将转好的PVDF膜置于封闭液中，并置于水平振荡器上室温封闭lh。
[0063] 所述封闭液组分为：5. 0g脱脂奶粉溶解于100mL TBST缓冲液；所述的TBST缓冲 液组分为：NaC18. 8g，1M Tris - HC1 (ρΗ8· 0) 20mL，吐温-20 0· 5mL，去离子水 980mL。
[0064] 一抗杂交：将封闭完的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床37°C、150rpm孵育 lh〇
[0065] 所述的一抗溶液组分为：将抗His -兔多克隆抗体以1 :5000溶在封闭液中。
[0066] 洗膜：将一抗孵育完的PVDF膜转入TBST缓冲液中，在摇床上震荡清洗3次，每次 l〇min ;之后再在TBS缓冲液中清洗1次，10min。
[0067] 所述TBS缓冲液是指不含吐温-20组分的TBST缓冲液。
[0068] 二抗杂交：将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滚动摇床37°C、150rpm孵 育lh。
[0069] 所述的二抗溶液组分为：将羊抗兔IgG - HRP以1 :5000溶在封闭液中。
[0070] 洗膜：同前。
[0071] 染色：将染色液均匀涂抹于PVDF膜上，静置lmin。通保鲜膜包好PVDF膜，置于X -光片盒中，并用透明胶带固定。
[0072] 所述的染色液组分是将EasySee Western Blot Kit(TRANSGEN)中 500μ L溶液A、 500 μ L溶液Β与1 μ L溶液C混合。于暗室中压片洗膜显影，结果如图3所示。
【权利要求】
1. 一种木质素过氧化物酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达木质素过氧化 物酶的大肠杆菌； 所述的胞内木质素过氧化物酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1木质素过氧化物酶基因 SG -LIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示，编码该木质素过氧化物酶核苷酸序列为1278bp，共编码425个氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日。
3. -种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌 基因组DNA为模板，与含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物进行PCR扩增得到编码木质素 过氧化物酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体PET -41a(+)，再将 获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得木质素过氧化物酶过表达重组菌株。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引 物，即含有Spe I和EcoR I酶切位点引物，具体包括： Lip - Spe I - F:GACTAGTATGGCTGACCCTTCCCTGTCGCA Lip - EcoR I - R:GGAATTCTCACCCCTCCAGCAGCGCCTGAC〇
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性 3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个循环后68°C终延伸3min。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为 Transetta(DE3)大肠杆菌。
7. -种根据上述任一权利要求所述的木质素过氧化物酶的工程菌的应用，其特征在 于，将其用于木质素过氧化物酶的体外高效表达，并用于木质素过氧化物酶的规模化发酵 生产。
【文档编号】C12R1/19GK104232556SQ201410462409
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】周培, 冯海玮, 支月娥, 孙玉静 申请人:上海交通大学