基于木质素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种基于木质素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码漆酶的核苷酸序列、编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列和编码锰过氧化物酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的序列依次连接到共表达载体、将扩增得到的序列连接到重组表达载体，最终得到重组共表达载体和重组表达载体；之后将重组共表达载体与重组表达载体先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。本发明能够应用基因工程手段实现漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶体外的大量表达合成，最终应用于实现木质素的原位快速降解。
【专利说明】基于木质素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰 略红链霉菌的基于漆酶、木质素过氧化酶和锰过氧化物酶的工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生 的主要干物质，主要包括纤维素、木质素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用 产生的木质纤维素总千重为1730亿t，所含总能量高达2X 1018KJ，相当于每年全世界消耗 能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，涉及众多酶系的 参与。
[0003] 木质纤维素中的木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5 -羟基松柏醇、芥子 醇）形成的一种复杂酚类聚合物。根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香 基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素 （S -木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合 而成的愈创木基木质素 （G -木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟 基苯基木质素（H-木质素）。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质 素（G)，双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素 （G - S)，单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素 （G - S - H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、 导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代 的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、木质素一起，形成植物骨架的主要成 分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导 组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。
[0004] 由于木质素的复杂结构，高分子量及高度疏水性，与纤维素与木质素相比，木质素 的降解相对较难。木质素降解过程中起主要作用的酶有漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧 化物酶等。已证实，自然中的细菌、真菌乃至放线菌均具有上述三种木质素降解酶的合成能 力。与真核生物相比，原核生物具有生长速度较快，且基因无内含子，具有易克隆、易表达等 优势。链霉菌作为土壤中常见的一类细菌（放线菌），对多数高分子化合物具有较强的分解 通力并在碳循环中起至关重要的作用。其中灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1经证实具有很强的木质素降解能力。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术中漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶在灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)内多为诱导表达且表达水平很低的缺陷，提出一种基于木 质素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法，通过全基因组测序分析，从该链霉菌基因组 分离到与木质素降解有关的基因序列，其中包括编码漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化 物酶的基因序列。本发明通过对灰略红链霉菌内相关基因（GC含量70%以上）进行序列优 化后进行全基因合成，并将目的基因序列插入到共表达载体中，最终实现木质素降解关键 酶的体外共表达。本发明对灰色链霉菌内木质素降解通路的研究、新型木质素降解酶制剂 的研发乃至实现木质素的快速降解均具有重要意义。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明涉及一种木质素代谢通路关键酶的工程菌，该工程菌为通过全基因合成获 得的漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的重组过表达菌株。
[0008] 所述的木质素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。
[0009] 所述的漆酶的核苷酸序列Lac，如SEQ ID No. 1所示，木质素过氧化物酶的核苷 酸序列Lip，如SEQ ID No. 2所示，锰过氧化物酶的核苷酸序列Μηρ，如SEQ ID No. 3所 示；其中：漆酶的基因序列为90〇bp，编码299个氨基酸；木质素过氧化物酶的基因序列为 1278bp，编码425个氨基酸；锰过氧化物酶的基因序列为2226bp，编码741个氨基酸。
[0010] 所述的全基因合成是指：通过对灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)漆 酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E. coli K12,回 避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖 riio因子的转录终止子及核糖体结合位点。
[0011] 所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。
[0012]
[0013] 本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成 构建得到的PUC57 - Lac、pUC57 - Lip和pUC57 - Μηρ载体为模板，分别与对应含有酶切位 点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码漆酶的核苷酸序列Lac、编码木质素过氧化物 酶的核苷酸序列Lip和编码锰过氧化物酶的核苷酸序列Μηρ ;然后将扩增得到的序列Lac 和Lip依次连接到共表达载体pETDuet - 1、将扩增得到的序列Μηρ连接到重组表达载体 pET -22b(+),最终得到重组共表达载体pETDuet - Lac - Lip和重组表达载体ρΕΤ -22 - Μηρ ; 之后将重组共表达载体pETDuet - Lac - Lip与重组表达载体ρΕΤ - 22 - Μηρ先后转化到大 肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。
[0014] 所述的含有酶切位点的引物包括：
[0015] Lac - Nco I - F:TACCATGGCTACCGCTACCGCTCGTACCGCTCCG
[0016] Lac - BamH I - R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
[0017] Lip - Nde I - F:TACATATGGCTGACCCGTCTCTGTCTCAGACCCG
[0018] Lip - Xho I - R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCTTCCAGCAGAGCCTGA
[0019] Mnp - Msc I - F:GATGGCCATGACCGAAAACCACGACGCTATCGTTA
[0020] Mnp - Xho I - R:CCCTCGAGTTAAACCAGGTCGAAACGGTCCAGGTTCATAACTTTGTC
[0021] 所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，60°C退火15s，72°C延 伸15s ;30个循环后72°C终延伸3min。
[0022] 所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0023] 本发明涉及一种木质素代谢通路的工程菌的应用，将其用于木聚糖酶和木糖苷酶 的体外高效表达，并最终实现木质素的原位快速降解。 技术效果
[0024] 现有木聚糖酶和木糖苷酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限 制了其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的木聚糖酶和木糖苷酶 基因序列；在特殊条件下（如高温以及碱性）具有更稳定的生物学活性；本发明通过构建 外源表达载体，实现了木聚糖酶和木糖苷酶的体外共表达，并通过在重组蛋白C端添加聚 组氨酸标签的方法，保证了纯化蛋白的质量；使用新型大肠杆菌表达宿主，最大程度提高蛋 白活性与可溶性。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为基于JCat预测漆酶基因序列优化前后密码子利用率对比图；
[0026] 图2为基于JCat预测木质素过氧化物酶基因序列优化前后密码子利用率对比 图；
[0027] 图3为基于JCat预测锰过氧化物酶基因序列优化前后密码子利用率对比图。
【具体实施方式】
[0028] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0029] 本实施例中灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)分离自上海市浦江镇收 集的腐烂秸杆，保藏编号为CGMCC No. 5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32?培养48h。
[0030] 上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液体培养基中加入15. 0 - 20. 0g/L琼脂即得LB固体培养基。
[0031] 1)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组 DNA 提取：收集 2. OmL 菌 液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180 μ L溶菌酶（20mg/mL)和20 μ L 已0丁八溶液（0.珊卬118.0)，37<€处理4511^1!，加入4"1^似36六（10011^/1^)，震荡混匀158，室 温放置 5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN)操作说明完成剩余操作，得到高纯度 基因组DNA。通过0.8°%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因 组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0032] 2)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组测序：确定全基因组 鸟枪法（WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用niumina Miseq(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤， 随后采用Newbler ν2·8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建contig及scaffold，最 后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0033] 3)蛋白编码基因功能预测：采用Glimmer 3. 0软件对全基因组序列进行基因预 测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作 为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预 测，设定开放阅读框的长度为110bp，其余参数为Glimmer 3.0的默认设置。
[0034] 4)木质素代谢通路编码基因序列的优化及人工合成：通过jCat在线程序对灰略 红链霉菌（Streptomyces griseorubens)漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因序 列进行优化，设定表达宿主为E.coli K12,回避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点，基因序 列优化前后密码子使用频率对比图如图1和图2所示。全基因合成优化后的基因序列并分 别构建到PUC57载体，得到pUC57 - Lac、pUC57 - Lip和pUC57 - Μηρ质粒。经过序列优化， 基因密码子使用率大幅度提高，更适合在大肠杆菌宿主细胞内进行表达。 实施例2
[0035] 共表达载体的构建
[0036] 1)根据优化后核苷酸序列，设计含有酶切位点的PCR引物序列如下：
[0037] Lac - Nco I - F:TACCATGGCTACCGCTACCGCTCGTACCGCTCCG
[0038] Lac - BamH I - R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
[0039] Lip - Nde I - F:TACATATGGCTGACCCGTCTCTGTCTCAGACCCG
[0040] Lip - Xho I - R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCTTCCAGCAGAGCCTGA
[0041] Mnp - Msc I - F:GATGGCCATGACCGAAAACCACGACGCTATCGTTA
[0042] Mnp - Xho I - R:CCCTCGAGTTAAACCAGGTCGAAACGGTCCAGGTTCATAACTTTGTC
[0043] 2)以pUC57 - Lac为模板，用含有Nco I和BamH I酶切位点的引物进行PCR扩 增扩增获得漆酶基因序列，使用DNA A-Tailing Kit加 A后连接到T-Vector PMD? 19_T(TaKaRa)，并将连接产物转入DH5a大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。 若无误，Nco I和BamH I进行双酶切（37°C)，回收漆酶DNA片段Lac。用相同内切酶酶切共 表达载体pETDuet -1并回收载体DNA片段。将Lac与载体片段混合，T4DNA Ligase (TaKaRa) 过夜连接（16°C)，将连接产物转入?Ηδα大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落 PCR筛选含有质粒pETDuet -Lac阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（50 μ g/ mL)的LB液体培养基中，180rpm、37°C培养16小时后提取质粒。
[0044] 以pUC57-Lip为模板，用含有Nde I和Xho I酶切位点引物进行PCR扩增获得木质 素过氧化酶基因序列，加 A后连接到PMD? 19_T，将连接产物转入DH5a大肠杆菌内。挑选 阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用Nde I和Xho I双酶切该质粒，回收木质素 过氧化酶DNA片段Lip。相同内切酶处理重组表达载体pETDuet -Lac并回收载体DNA片段。 将Lip与pETDuet-Lac载体片段混合，T4DNA Ligase过夜连接，将连接产物转入DH5a大肠 杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组共表达载体PETDuet -Lac -Lip 的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒。
[0045] 以pUC57 -Mnp为模板,用含有Msc I和Xho I酶切位点引物进行PCR扩增获得锰 过氧化物酶基因序列，加 A后连接到PMD? 19-T，将连接产物转入?Ηδα大肠杆菌内。挑选 阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用Msc I和Xho I双酶切该质粒，回收锰过氧 化酶DNA片段Mnp。相同内切酶处理重组表达载体PET - 22b(+)并回收载体DNA片段。将 Μ叩与pET-22b(+)载体片段混合，T4DNA Ligase过夜连接，将连接产物转入DH5a大肠杆 菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组表达载体PET _22 -Mnp的阳性克 隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒。
[0046] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，6〇°C退火l5s，72°C延伸 15s ;30个循环后72°C终延伸3min。
[0047] 上述 PCR 反应使用的 DNA 聚合酶为 _eS_R? Max DNA Polymerase (TaKaRa)。
[0048] 3)重组共表达菌株的构建：
[0049] 将上述含有漆酶与木质素过氧化物酶编码基因的共表达载体pETDuet - Lac - Lip 与含有锰过氧化物酶编码基因的表达载体PET - 22 - Μηρ先后转入TransB (DE3)大肠杆菌， 最终在同时含有氨苄青霉素（50 μ g/mL)、氯霉素（25 μ g/mL)、卡那霉素（25 μ g/raL)和四环 素（20 μ g/mL)的LB固体培养基上筛选，获得漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共表 达重组菌株。
[0050] 上述的TransB(DE3)具有以下特征：具有卡那霉素（KanR)和四环素（TetR)抗性， 此外，该菌株还包含突变的硫氧还蛋白还原酶（trxB)和谷胱甘肽还原酶（gor)基因，表达 主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶 性。
【权利要求】
1. 一种木质素代谢通路关键酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为通过全基因合成获 得的漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的重组过表达菌株； 所述的木质素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌（Str印tomyces griseorubens) JSD - 1漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，其中：漆酶的核苷酸序列Lac，如SEQ ID No. 1所示，木质素过氧化物酶的核苷酸序列Lip，如SEQ ID No. 2所示，锰过氧化物酶的核 苷酸序列Μηρ,如SEQ ID No. 3所示。
2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌（Str印tomyces grise〇rUbens)JSD- 1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日。
3. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的全基因合成是指：通过对灰略红链 霉菌（Streptomyces griseorubens)漆酶、木质素过氧化物酶和猛过氧化物酶基因序列进 行优化，设定表达宿主为 E.coli K12,回避 Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I 和 EcoR I 酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。
4. 一种根据权利要求1?3中任一所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红 链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到的PUC57 - Lac、pUC57 - Lip和pUC57 - Μ叩载 体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码漆酶的核苷 酸序列Lac、编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列Lip和编码锰过氧化物酶的核苷酸序列 Μηρ ;然后将扩增得到的序列Lac和Lip依次连接到共表达载体pETDuet -1、将扩增得到的 序列Μηρ连接到重组表达载体pET - 22b (+)，最终得到重组共表达载体pETDuet - Lac - Lip 和重组表达载体pET - 22 - Μηρ ;之后将重组共表达载体pETDuet · Lac - Lip与重组表达载 体pET - 22 - Μηρ先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括： Lac - Nco I - F:TACCATGGCTACCGCTACCGCTCGTACCGCTCCG Lac - BamH I - R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC Lip - Nde I - F:TACATATGGCTGACCCGTCTCTGTCTCAGACCCG Lip - Xho I - R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCTTCCAGCAGAGCCTGA Mnp - Msc I - F:GATGGCCATGACCGAAAACCACGACGCTATCGTTA Mnp - Xho I - R:CCCTCGAGTTAAACCAGGTCGAAACGGTCCAGGTTCATAACTTTGTC〇
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性 3min ;98°C变性 l〇s，6〇°C退火 l5s，72°C延伸 15s ;30 个循环后 72°C终延伸 3min。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为 Transetta(DE3)大肠杆菌。
8. -种根据上述任一权利要求所述的木质素代谢通路关键酶的工程菌的应用，其特征 在于，将其用于漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的体外高效表达，并最终实现木质 素的原位快速降解。
【文档编号】C12N9/08GK104152390SQ201410374644
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】周培, 冯海玮, 孙玉静, 支月娥, 罗艳青 申请人:上海交通大学