一种木质素酶及生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用细菌液体深层发酵技术工业化生产木质素酶生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即阿拉提芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis），实验室编号为KERR7989，保藏号：CGMCC?NO：6225，所述木质素酶为碱性酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，其酶作用pH范围在pH4.5～11.0、作用温度范围在20℃～75℃，本发明酶活力高，标准木质素酶液≥500u/ml，单位生产成本低，发酵周期短，工业化程度高，工艺过程简单易控，适合在造纸行业应用，可降低造纸生产成本和环境污染，同时有助提高纸的产品品质，还可用于污水工程和生物酶制剂降解毒素等领域。
【专利说明】一种木质素酶及生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物酶制剂的工业化生产，具体地说是一种木质素酶及生产方法。
【背景技术】
[0002] 木质素酶是具有催化木质素氧化降解能力的一类酶的总称，这类酶催化氧化还原反应，系统名为氧化还原酶，俗名为脱氢酶，其包括四个组份:漆酶即系统名为本二酚氧化还原酶，作用与邻醌醇和对醌醇，氨基苯酚和本二胺的氧化反应；木质素过氧化物酶即系统名为木质素过氧化氢氧化还原酶，催化木质素的氧化反应；锰过氧化物酶即系统名为二价锰过氧化氢氧化还原酶，催化二价锰氧化成三价锰的反应，是木质素氧化降解；二芳基丙烷过氧化物酶又称木质素酶I即系统名为二芳基丙烷:氧，过氧化氢氧化还原酶，催化许多相关典型化合物碳一碳键的断裂和苯甲醇氧化生成醛或酮。
[0003]木质素酶不仅对木质素，而且对许多种类的有机物尤其是人工合成的有机污染物都有很强的降解能力，而且具有高谱、高效、低耗、高适用性等特点。这种特殊的降解机制在饲料工业、化学工业、煤炭化学和环境保护方面展现了巨大的应用前景，已经引起了学术界和工业界的广泛关注。而目前木质素酶的生产大多采用合成培养基，进行液态深层发酵生产，必须添加昂贵的诱导物藜芦醇，并且发酵周期长，生产成本高，酶活低，难于进行大规模的生产。最近的几十年，学者逐渐开始用固态发酵技术生产木质素酶。它可模仿天然微生物的生长过程，生产人们需要的产品，但产量很低。产木质素酶的微生物一般都是丝状真菌，固态发酵是模拟真菌的天然生长条件，因此适合培养丝状真菌产酶。但是发酵不均匀，菌体生长、营养物的吸收和代谢产物的分泌在各处都是不均匀的，使得发酵参数(PH，温度，培养条件等)的检测和控制都比较困难，实现工业化困难。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种采用细菌液体深层发酵技术工业化生产木质素酶及生
产方法。
[0005]本发明酶活力的测定方法:配置0.2mg/L的丁香醛连氮溶液装入黑色试剂瓶中冰箱保存5天内有效。使用时将其用25mmol/L pH7.5的Tris缓冲液稀释10倍，吸取2.5ml该底物溶液中加入0.5ml适当稀释的酶溶液，30°C准确计时反应5min，在530nm测光吸收值。酶活力定义为，酶在测定条件下每小时作用底物使吸光值每增加1.0个单位时定义为I个酶活力单位(U)。
[0006]本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的，一种木质素酶的生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即阿拉提芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)，实验室编号为KERR7989，保藏号:CGMCC NO:6225，其生物学特性为:革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈杆状，以二分裂方式增殖；芽孢形成后菌体不膨大，在本发明所述培养基上菌落呈圆形，污白色、着色均匀，边缘整齐，略有光泽，黏稠。[0007]本发明的菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，筛选出一株实验室编号为KERR7989的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为阿拉提芽孢杆菌(Bacillus altitudinis),该菌种已于2012年06月15日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号=CGMCC NO:6225，并于同日提交了保藏存活证明。
[0008]本发明所述的菌种培养为CGMCC NO:6225菌种在如下配制的斜面上生长良好，斜面培养基配方为:1000mL蒸懼水中，加入牛肉膏5g~IOg,酵母膏5g~IOg,蛋白胨IOg~15g,葡萄糖5g~IOg,氯化钠3g~8g,调pH值6.9~7.1,0.1MPa灭菌20分钟~30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33°C~35°C，培养18小时~24小时后，放入5°C冰箱中备用，或向菌斜面上注入已灭菌液体石蜡后保藏或以脱脂牛奶为载体冷冻干燥真空封口保藏。
[0009]本发明所述的摇瓶发酵为CGMCC NO:6225菌种在规定的培养条件下可产生高活力的木质素酶，这种培养条件是:以质量计，培养基配方为:麦麸6 %~8 %、纤维质粉I%~2 %、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、磷酸氢二钾0.1 %~0.2 %、蛋白胨0.5 %~I %、硫酸镁0.03 %~0.05 %、碳酸钠0.2 %~0.3 %，水85.95%~90.7 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为8.0~8.5，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟，培养条件:33°C~35°C，摇床转速260 r/分钟~280r/分钟，培养48小时~52小时。
[0010]本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面制得细胞液体种子到种子罐，再到产酶发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。
[0011]本发明的种子培养基配方为:以质量计，麦麸5 %~6 %、玉米粉I %~2 %、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、氯化钠0.4 %~0.6 %、碳酸钠I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、水86.9 %~91.3 %， 其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为6.5~7.0，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟；种子罐装料总体积不超过70 %，培养条件为:温度33°C~38°C，搅拌转速180 r/min~220 r/min，通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.25~0.27，4 小时~6 小时，1:0.33 ~0.36，6 小时以后，1:0.50 ~0.55，罐压0.06 MPa~0.08MPa，培养周期为7小时~9小时。
[0012]本发明产酶发酵罐的培养基配方为:以质量计,麦麸6 %~8 %、纤维质粉I %~
2%、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、磷酸氢二钾0.1 %~0.2%、蛋白胨0.5 %~I %、硫酸镁0.03 %~0.05 %、碳酸钠0.2 %~0.3 %、水85.95 %~90.87 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为8.0~8.5，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟，装料总体积不超过70% ;培养条件:温度33°C~38°C，搅拌转速180 r/min~220 r/min，通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.30~0.32，4小时~6小时，1: 0.40~0.42，6小时以后1:0.50~0.55，罐压0.06 MPa~0.07MPa，发酵周期为36小时~42小时。
[0013]本发明为促进产酶，提高木质素酶的活力，在产酶发酵罐的培养基配方中加入0.3%~0.5 %的蔗糖或/和0.003 %~0.005 %的硫酸铜，相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100 %，可显著提高木质素酶活力。
[0014]本发明在制备标准化酶液中，将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15°C密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95 %以上的标准木质素酶液。
[0015]本发明为去杂除菌，提高产品质量，发酵醪液经板框过滤后，在发酵滤液中加入十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钙取杂除菌，其用量分别为发酵滤液质量的2.8 %~
3.5 %和 1.0 % ~1.3 %。
[0016]一种如上述方法生产的木质素酶，所述木质素酶为碱性酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，其酶作用PH范围在pH4.5~11.0、作用温度范围在20°C~75?。
[0017]由于采用上述技术方案，本发明较好的实现了发明目的，其酶活力高，标准木质素酶液> 500 u/ml，单位生产成本低，发酵周期短，工业化程度高，工艺过程简单易控，适合在造纸行业应用，可降低造纸生产成本和环境污染，同时有助提高纸的产品品质，还可用于污水工程和生物酶制剂降解毒素等领域。【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0019]一种木质素酶的生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即阿拉提芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，实验室编号为KERR7989，保藏号:CGMCC NO:6225，其生物学特性为:革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈杆状，以二分裂方式增殖；芽孢形成后菌体不膨大，在本发明所述培养基上菌落呈圆形，污白色、着色均匀，边缘整齐，略有光泽，黏稠。
[0020]本发明的菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，筛选出一株实验室编号为KERR7989的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为阿拉提芽孢杆菌(Bacillus altitudinis),该菌种已于2012年06月15日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号=CGMCC NO:6225，并于同日提交了保藏存活证明。
[0021]本发明所述的菌种培养为CGMCC NO:6225菌种在如下配制的斜面上生长良好，斜面培养基配方为:1000mL蒸懼水中，加入牛肉膏5g~IOg,酵母膏5g~IOg,蛋白胨IOg~15g,葡萄糖5g~IOg,氯化钠3g~8g,调pH值6.9~7.1,0.1MPa灭菌20分钟~30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33°C~35°C，培养18小时~24小时后，放入5°C冰箱中备用，或向菌斜面上注入已灭菌液体石蜡后保藏或以脱脂牛奶为载体冷冻干燥真空封口保藏。
[0022]本实施例斜面培养基配方为:1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨IOg,葡萄糖5g，氯化钠5g，用氢氧化钠调调pH值7.0，0.1MPa灭菌30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，34°C，培养22小时后，放入5°C冰箱中备用。
[0023]该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后，可以作为种子扩培使用或发酵产酶使用。
[0024]本发明所述的摇瓶发酵为CGMCC NO:6225菌种在规定的培养条件下可产生高活力的木质素酶，这种培养条件是:以质量计，培养基配方为:麦麸6 %~8 %、纤维质粉I%~2 %、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、磷酸氢二钾0.1 %~0.2 %、蛋白胨0.5 %~I %、硫酸镁0.03 %~0.05 %、碳酸钠0.2 %~0.3 %，水85.95%~90.7 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为8.0~8.5，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟，培养条件:33°C~35°C，摇床转速260 r/分钟~280r/分钟，培养48小时~52小时。
[0025]本实施例培养基配方为:以质量计,麦麸8 %、纤维质粉2 %、氮含量40 %的玉米浆2 %、硫酸铵0.3 %、磷酸氢二钾0.2 %、蛋白胨0.5 %、硫酸镁0.03 %、碳酸钠0.2 %，水86.77 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为8.2，0.1MPa灭菌30分钟，培养条件:35°C，摇床转速280r/分钟，培养50小时。
[0026]本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面制得细胞液体种子到种子罐，再到产酶发酵罐，二级发酵，制备标准 化酶液。
[0027]本发明的种子培养基配方为:以质量计，麦麸5 %~6 %、玉米粉I %~2 %、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、氯化钠0.4 %~0.6 %、碳酸钠I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、水86.9 %~91.3 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为6.5~7.0，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟；种子罐装料总体积不超过70 %，培养条件为:温度33°C~38°C，搅拌转速180 r/min~220 r/min，通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.25~0.27，4 小时~6 小时，1:0.33 ~0.36，6 小时以后，1:0.50 ~0.55，罐压0.06 MPa~0.08MPa，培养周期为7小时~9小时。
[0028]本实施例的种子培养基配方为:以质量计,麦麸5 %、玉米粉1.5 %、氮含量40 %的玉米浆2 %、氯化钠0.5 %、碳酸钠1.5%、硫酸铵0.5 %、水89.0 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为6.5，0.1MPa灭菌35分钟；种子罐装料总体积不超过70 %，培养条件为:温度35°C，搅拌转速220 r/min，通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.25，4小时~6小时，1:0.33，6小时以后，1:0.50，罐压0.06 MPa，培养周期为7小时。培养4h后每隔一小时取样镜检，观察菌生长发育，繁殖情况。当培养到菌体细胞链70 %断裂为单个细胞，表明种子已接近成熟，做好转罐接种的各项准备工作。
[0029]本发明产酶发酵罐的培养基配方为:以质量计,麦麸6 %~8 %、纤维质粉I %~
2%、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、磷酸氢二钾0.1 %~0.2%、蛋白胨0.5 %~I %、硫酸镁0.03 %~0.05 %、碳酸钠0.2 %~0.3 %、水85.95 %~90.87 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为8.0~8.5，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟，装料总体积不超过70% ;培养条件:温度33°C~38°C，搅拌转速180 r/min~220 r/min，通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.30~0.32，4小时~6小时，1: 0.40~
0.42，6小时以后1:0.50~0.55，罐压0.06 MPa~0.07MPa，发酵周期为36小时~42小时。
[0030]本实施例产酶发酵罐的培养基配方为:以质量计,麦麸8 %、纤维质粉2 %、氮含量40 %的玉米浆I %、硫酸铵0.35 %、磷酸氢二钾0.15 %、蛋白胨0.5 %、硫酸镁0.03 %、碳酸钠0.22 %、水87.75 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为8.0，0.1MPa灭菌33分钟，装料总体积不超过70 % ;培养条件:温度35°C，搅拌转速220 r/min，通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.30，4小时~6小时，1:0.40，6小时以后1: 0.55，罐压0.06MPa，发酵周期为40小时。
[0031]其酶活力最高可达到580u/ml,平均水平可达500u/ml以上。
[0032]放罐条件:罐温不再上升；酶活力不再增加；ρΗ9.0左右；细胞95 %以上出现芽孢，并有部分自溶。将发酵醪液PH调至8.5左右。滤液酶活力500u/ml。[0033]本发明为促进产酶，提高木质素酶的活力，在产酶发酵罐的培养基配方中加入0.3%~0.5 % (本实施例为0.4 %)的蔗糖时，相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100% ,可显著提高木质素酶活力。木质素酶活力由对照的500u/ml增加到575u/ml，提高约15%。
[0034]或者加入0.003 %~0.005 % (本实施例为0.003 %)的硫酸铜，相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100 %，可显著提高木质素酶活力。木质素酶活力由对照的500u/ml 增加至Ij 550u/ml，提高约 10 %。
[0035]或者同时加入蔗糖和硫酸铜，也可显著提高木质素酶活力。
[0036]本发明在制备标准化酶液中，将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15°C密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95 %以上的标准木质素酶液。
[0037]本发明去杂除菌，提高产品质量，发酵醪液经板框过滤后，在发酵滤液中加入十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钙取杂除菌，其用量分别为发酵滤液质量的2.8 %~3.5 %(本实施例为3.2 % )和1.0 %~1.3 % (本实施例为1.2%)。
[0038]本发明也可使用其它无机盐组合替代，例如硫酸钠与二水合氯化钙组合。
[0039]本发明所述的CGMCC NO:6225菌种可利用多种碳、氮源产酶。所述的碳源如甘蔗渣、麦麸、玉米轴粉、玉米秸杆粉、稻草粉、玉米油渣、纤维质粉、花生外壳粉等，可单独或混合用。所述的氮源如无机氮中的硫酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵等生理酸性盐，硝酸钠生理碱性盐，硝酸铵生理中性盐。尿 素、玉米浆、玉米浆粉、玉米蛋白粉、大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏等有机氮，可单独或混合用。
[0040]一种如上述方法生产的木质素酶，所述木质素酶为碱性酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，其酶作用PH范围在pH4.5~11.0、作用温度范围在20°C~75?。
[0041]本发明木聚糖酶不含纤维素酶活性，酶活力高，其作用温度和pH适合在造纸行业应用，可降低造纸生产成本和环境污染，有助提高纸的产品品质，还可用于污水工程和生物酶制剂降解毒素等领域。
【权利要求】
1.一种木质素酶的生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即阿拉提芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，实验室编号为KERR7989，保藏号:CGMCC N0:6225，其生物学特性为:革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈短杆状，单个细胞直径小于I微米，以二分裂方式增殖；芽孢位于菌体中央或稍偏，在本发明所述培养基上菌落呈圆形，灰白色、着色均匀，边缘整齐，略有光泽，表面湿润，黏稠。
2.根据权利要求1所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是所述的菌种培养为CGMCC NO:6225菌种在如下配制的斜面上生长良好，斜面培养基配方为:1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g~IOg,酵母膏5g~IOg,蛋白胨IOg~15g,葡萄糖5g~IOg,氯化钠3g~8g,调pH值6.9~7.1，0.1MPa灭菌20分钟~30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33°C~35°C，培养18小时~24小时后，放入5°C冰箱中备用，或向菌斜面上注入已灭菌液体石蜡后保藏或以脱脂牛奶为载体冷冻干燥真空封口保藏。
3.根据权利要求1所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是所述的摇瓶发酵为CGMCC NO:6225菌种在规定的培养条件下可产生高活力的木质素酶，这种培养条件是:以质量计，培养基配方为:麦麸6 %~8 %、纤维质粉I %~2 %、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、磷酸氢二钾0.1 %~0.2 %、蛋白胨0.5 %~I %、硫酸镁0.03%~0.05 %、碳酸钠0.2 %~0.3 %，水85.95 %~90.7 %，其中所述各组分之和为100%，灭菌前，调pH值为8.0~8.5，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟，培养条件:33°C~35 °C，摇床转速260 r/分钟~280r/分钟，培养48小时~52小时。
4.根据权利要求1所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是所述的酶液制备为由茄瓶斜面制得细胞液体种子到种子罐，再到产酶发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。
5.根据权利要求4所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是种子培养基配方为:以质量计，麦麸5 %~6 %、玉米粉I %~2 %、氮含量40 %的玉米衆I %~2 %、氯化钠0.4%~0.6 %、碳酸钠I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、水86.9 %~91.3 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调pH值为6.5~7.0，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟；种子罐装料总体积不超过70 %，培养条件为:温度33°C~38°C，搅拌转速180 r/min~220 r/min,通气量以v/v计:0小时~4小时，1:0.25~0.27，4小时~6小时，1:0.33~0.36，6小时以后，1:0.50~0.55，罐压0.06 MPa~0.08MPa，培养周期为7小时~9小时。
6.根据权利要求4所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是产酶发酵罐的培养基配方为:以质量计，麦麸6 %~8 %、纤维质粉I %~2 %、氮含量40 %的玉米浆I %~2 %、硫酸铵0.3 %~0.5 %、磷酸氢二钾0.1 %~0.2 %、蛋白胨0.5 %~I %、硫酸镁0.03 %~0.05 %、碳酸钠0.2 %~0.3 %、水85.95 %~90.87 %，其中所述各组分之和为100 %，灭菌前，调PH值为8.0~8.5，0.1MPa灭菌25分钟~35分钟，装料总体积不超过70 % ;培养条件:温度33°C~38°C,搅拌转速180 r/min~220 r/min,通气量以v/v计:0小时~4小时，I:0.30~0.32，4小时~6小时，1:0.40~0.42，6小时以后1:0.50~0.55，罐压0.06 MPa~0.07MPa,发酵周期为36小时~42小时。
7.根据权利要求6所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是在产酶发酵罐的培养基配方中加入0.3 %~0.5 %的蔗糖或/和0.003 %~0.005 %的硫酸铜，相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100 %，可显著提高木质素酶活力。
8.根据权利要求4所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是在制备标准化酶液中，将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15°C密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95 %以上的标准木质素酶液。
9.根据权利要求8所述的一种木质素酶的生产方法，其特征是发酵醪液经板框过滤后，在发酵滤液中加入十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钙去杂除菌，其用量分别为发酵滤液质量的2.8 %~3.5 %和1.0 %~1.3 %。
10.一种根据权利要求1所述方法生产的木质素酶，其特征是所述木质素酶为碱性酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，其酶作用PH范围在PH4.5~`11.0、作用温度范围在201:~75°C。
【文档编号】C12R1/07GK103540573SQ201310490352
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月19日 优先权日:2013年10月19日
【发明者】杨忠义, 李忠兴 申请人:沅江浣溪沙酶技术有限公司