一种强化酶解法提取烟叶木质素的预处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及木质素提取领域，更具体地，涉及一种强化酶解法提取烟叶木质素的 预处理方法。
【背景技术】
[0002] 随着烟草工业的不断发展，吸烟与健康问题备受关注，降焦减害成了烟草工业发 展的必然趋势。而烟叶中的木质素是烟焦油中稠环芳烃类、芳香胺等有害物质的主要来源。 研宄表明，木质素的热裂解产物主要含有甲氧基、羟基和烷基的苯酚类物质（木质素快速 热裂解试验研宄.2005, 39(5) : 710-714)。卷烟在吸燃的过程中，烟草中的木质素完全有可 能会裂解产生具有促癌作用的各种酚类物质。研宄烟草木质素在卷烟吸燃条件下的热裂解 机理可以对于卷烟的降焦减害提供新的思路。而研宄烟草木质素的热裂解之前，必须从烟 草中分离结构变化较小的木质素。
[0003] 从植物中分离木质素的方法有很多，传统的分离木质素的方法是采用硫酸将植物 原料中的碳水化合物水解，而木质素作为不溶物分离得到，然而，在浓硫酸的作用下，木质 素会缩合降解，结构发生较大的变化。有机溶剂法是利用有机溶剂将烟草中的木质素溶解 而实现将木质素的分离目的，而烟草中的木质素含量很少，有机杂质多，所以机溶剂法分离 烟草木质素存在收率低和有机杂质含量多等缺陷。
[0004] 纤维素酶解法分离木质素是近年来发展的一种新的分离木质素方法，利用纤维 素酶将烟叶中的纤维素和半纤维素酶水解成水溶性单糖，从而分离提取木质素。酶解 法具有分离条件温和，木质素结构改变较小等优点，为木质素的结构研宄提供很好的原 料。Wu S.和Argyropolos D. S.等采用酶解的方法分离木质素，结果表明这种方法得到 的酶解木质素和磨木木质素没有显著的区别，结构变化小（Journal ofpulp and paper science，2003, 29(7) :235-240)。但是，由于烟叶中的木质素含量较低，而果胶、蛋白质、淀 粉、油脂等有机质的含量较高，纤维素和木质素的紧密结合，以及半纤维素的对纤维素的包 裹作用，使得纤维素酶解法分离木质素存在酶解效率低的问题，从而导致残留少量纤维素 杂质。因此提高纤维素酶解效率成为了该方法的关键。
[0005] 近几年也有不少学者通过研宄不同的预处理方法来提高木质纤维素的酶解效 率。但现有的预处理方法均存在各种不足（Curr Opin Biotechnol, 2009, 20:339-347)。 例如：（1)蒸汽爆破：该方法是在几十个大气压下，150~240°C饱和水蒸气中经几十秒至 几分钟的瞬间处理之后，立即降至常压，经过膨爆的杨木经24h的纤维素酶处理可以达到 90%以上的消化率，但是高温高压下的饱和水蒸气使木质素的X-丙烯乙醚及部分B-丙 烯乙醚裂开，破坏木质素。（2)稀酸预处理：酸蒸气膨爆催化是研宄最细的一种处理方法， 在高温和酸的条件下蒸汽膨爆后木质素结构变化并不十分清楚，但是原来的结构很明显 改变了，使得木质素变得更加容易聚集。（3)碱预处理：虽然大多数的碱预处理都可以提 高酶解效率，但是依然会存在脱木质素的问题，氨膨爆是一种典型物理化学碱预处理，但 水解率一般只有40%~50%。肌6?61111(.(：.等研宄了恥011(0.5~10%，901：，111)，稀硫 酸（0. 5~6. 0%，121°C，lh)和热水（100°C，lh)三种预处理对酶水解效率的影响。实验 结果表明采用NaOH预处理后，柳枝稷的葡萄糖产生率比其他两种预处理方法高，但是木质 素的剩余率只有1/3左右，所以大部分的木质素在这个过程中发生了降解。（Holzforschu ng，1975, 29 (5) : 153-159)。也有相关的专利报导利用离子液体或者超声辅助提高木质纤维 素的酶解糖化效率（CN102154412A，CN101979642A，CN102533907A)。由于上述预处理方法 都是基于提高糖的转化率为目的，而忽略了木质素在预处理过程中的结构变化和木质素损 失导致收率低等问题。
[0006] 用于酶解法提取烟叶木质素的预处理方法主要有丙酮抽提（Journal ofpulp and paper science, 2003, 29(7) : 235-240)，但是耗时太长（48h);另外，苯 /甲苯一乙醇/乙醚的混合溶剂也常用于提取木质素的预处理（Industrial Crops Products.，2010, 32:551-559)。上述有机溶剂预处理方法不但耗时、危险，且对烟叶的预处 理效果也有待提尚。
【发明内容】
[0007] 为了能提高酶解的效率，本发明首先提供一种强化酶解法提取烟叶木质素的预处 理方法，包括以下步骤，将干燥的烟叶粉分散到氢氧化钠、尿素和水的混合水溶液中，搅拌， 过滤，洗涤至滤液为中性，干燥，得预处理后的烟叶粉。
[0008] 所述的干燥的烟叶粉的粒径为60~100目。
[0009] 所述混合水溶液，按重量百分比计，氢氧化钠的含量为5~10%，尿素的含量为 10~15%，余量为水。
[0010] 所述的分散的温度为-15~8°C。
[0011] 更进一步提供一种强化酶解法提取烟叶木质素的方法，将预处理后的烟叶粉分散 于缓冲溶液中，加入纤维素酶，在45~60°C温度下反应8~96h，得水解液，
[0012] 所述的预处理为上述的预处理方法，
[0013] 所述的纤维素酶的加入量为，以烟叶粉中的葡聚糖含量计，5~30FPU/g。
[0014] 所述的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲 液，pH = 4. 5~6. 0,离子强度为25~100mmol/L。
[0015] 所述的烟叶粉的质量和缓冲液的体积比为1~4:40~80g/ml。
[0016] 所述的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲溶液pH = 4. 8~5. 5,离子强度为 50mmol/L〇
[0017] 本发明的原理：
[0018] 样品经过氢氧化钠/尿素处理液预处理过程提高酶解效率的机理是：在低温下能 够氢氧化钠水合物与纤维素上羟基通过氢键驱动自组装形成包合物，从而破坏纤维素原有 的分子内和分子间氢键，由此把部分纤维素分子带入水溶液中，同时该条件下也可以除去 了烟草中的水溶性糖、蛋白质，游离性半纤维素和其他游离杂质，降低纤维素结晶度，但是 与植物细胞壁联接的木质素网络却不溶于这个溶剂体系。综上几个因素，都有利于在酶解 过程中，提高烟叶的顽抗性以及纤维素酶对纤维素的可及性，从而提高烟叶的酶解效率。
[0019] 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
[0020] 1)本发明的预处理方法能够明显提高木质素的酶解效率，有利于后续烟叶木质素 的提取和含量测定。
[0021] 2)本发明方法预处理条件是在低温（_15°C~-8°c )条件下进行，避免了传统方法 对原料中木质素结构的影响以及木质素的溶出损失。
[0022] 3)本发明方法使用试剂均无毒无污染，操作简单高效，使用试剂价格低廉易得。
【附图说明】
[0023] 图1是实施例1的预处理滤液的紫外吸收光谱对比图
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用 的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。实施例1
[0025] 称取10g烟叶粉，在_10°C的条件下将烟叶粉分散于250ml氢氧化钠、尿素和水的 混合溶液中，混合溶液中氢氧化钠、尿素和水的质量比为7:12:81。在维持-10°C的条件下 搅拌30min后，用600目的滤布进行过滤，保留滤液A用于紫外测试。并用纯水将固体洗 涤至中性，在50°C真空干燥24h得到预处理烟叶粉3. 6738g。采用美国国家可再生能源实 验室分析测试方法测定预处理烟叶的纤维素含量（NREL/TP-510-42618, Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. 2008)。称取 lg上述预处理后的烟叶 粉，加入到50mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，pH为4. 8,离子强度为50mmol/L，再加入20FPU/ g葡聚糖的纤维素酶（CTec2,诺维信中国生物技术有限公司提供），在50°C温度下反应72h。 反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，计算 得到酶解效率为99. 48%。
[0026] 图1是采用紫外可见分光光度计（厂家：日本岛津公司，型号：UV_2450)对本实施 例预处理所制的滤液进行扫描得到的紫外吸收光谱对比图，由图1可知：经冷冻至-10°c的 氢氧化钠/尿素体系在211nm和239nm处有两个明显的吸收峰，加入木质素后239nm处的 吸收峰明显增强；而滤液A的紫外吸收峰是在201nm，在240nm附近没有明显的吸收峰。这 表明滤液A中不含有木质素，所以该方法预处理不会导致烟叶中木质素的溶出，从而提高 木质素的提取率。
[0027] 另外，滤液A的紫外吸收峰蓝移可能与尿素分子和氢氧化钠水合物与烟叶溶出物 形成包合物有关。因为尿素分子和氢氧化钠水合物可以通过氢键包合淀粉、醇类、有机酸等 物质（Macromolecules, 2008, 41:9345 - 9351) 〇
[0028] 实施例2