专利名称：极暗黄链霉菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物技术领域，具体指一种对农作物病具有广谱拮抗作用，尤其对水稻纹枯病具有明显抑制作用的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。
背景技术：
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhzioeotniasoalni)引起的导致水稻减产的重要病害，可造成10%_30%的产量损失，发病严重时减产可达50%。近几年，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，水稻纹枯病的危害越来越严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井R霉素与一些化学药剂为主，长期单一使用井R霉素易导致立枯丝核菌产生抗药性，近年井R霉素每季用药次数已从20年前2次增加到现在的3-5次， 用药量也从I. 5 kg/hm2上升到4. 5-6. Okg/hm，而化学药剂存在毒性、残留、环境污染等缺点，且由于立枯丝核菌腐生能力强和寄主范围广的特点，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种。
且，随着化学杀菌剂对生态环境、有益生物及人体所引致负作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起各界的密切关注。发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种对农作物病具有广谱拮抗作用的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40,尤其对水稻纹枯病菌具有良好的抑制效果。
本发明所述的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40,已于2012年12 月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :M2012519，保藏地址中国武汉武汉大学。
本发明菌株CZB40具有以下性质
形态特征使用插片法在高氏I号培养基上28°C培养7d后，分别用光学显微镜和电子显微镜观察发现，本菌株具有典型的链霉菌属特征，菌落紧密、表面皱折，皮壳状，青褐色。气生菌丝和基内菌丝均很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝呈螺旋状，孢子呈短圆柱形，见图I。
生理生化特性本发明菌株CZB40在高氏一号固体培养基中生长产生暗黄色色素。本菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，使淀粉水解，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固，也不能产生硫化氢。
利用参照I. M. Kauffmann等及Jasmina Nikodinovic等的方法提取本发明菌株的基因组DNA，根据放线菌16SrDNA的结构特点及其保守区设计特异引物(引物由上海生工生物工程公司合成)
正向引物16sF AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (见 SEQ ID NO. I)；
反向引物16sR AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (见 SEQ ID NO. 2)。
以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增(50 μ L反应体系)94°C预变性5min， 94°C变性Imin，56°C复性Imin，72°C延伸2min，25个循环，72°C延伸8min。扩增产物经上海生工生物工程技术有限公司测序,序列经BLAST分析并构建系统发育树(见图2)表明，本发明菌株CZB40与极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)的相似性达99%。结合形态和生理生化特征分析，将其鉴定为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)的一个新种， 命名为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。
培养及发酵条件
培养基中的营养源并无特殊的规定，培养基中可含有常用于微生物培养的碳源、 氮源及其他营养源。其中，碳源可为葡萄糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖等。氮源可为NaN03、(MM)2SO4、酵母粉、蛋白胨、大豆粉等。其他营养源可为含镁、 钠、钾之类的金属盐等。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于本发明菌株的生长为宜。
将本发明菌株CZB40接种于发酵培养基中，可获得发酵液，发酵培养基为玉米粉 10-30g、酵母粉 3-7g、MgSO4 O. 2_lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、1000ml 水，pH 5-9 ； 发酵条件为接种量1-10% (体积)、温度26-30°C、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48-96h。通过单因素试验和均匀设计法对本发明菌株CZB40的发酵培养基和发酵条件进行优化，得到最佳培养基(1000ml水)为25g玉米粉、5g酵母粉、O. 2g MgSO4、0. 8gNaCl、 O. 4gK2HP04 pH 6 ;最佳发酵条件为接种量5%、温度29°C、转速200r/min、发酵时间72h。
本发明菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，尤其对水稻纹枯病菌抑制效果明显。
图I是本发明菌株CZB40的孢子形态图。
图2是本发明菌株的系统发育树。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，本文中提及的各病原菌均由湖南农业大学植物病理系提供。
实施例I
将从湖南省郴州市采集的土样于室温下风干，称取土样IOg放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡20min，用无菌移液管从中吸取Iml 土壤悬液注入盛有9ml 无菌水的试管中，混匀。从此试管中吸取Iml注入另一支盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制备10 -2、10 -3、10 —4、10 —5、10 —6的土壤稀释液。用无菌移液管吸取10 -2、10 -4、10 -6 稀释液O. ImL分别滴加到加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀， 静置30min后,将培养皿放在28°C温箱中倒置培养。及时挑单菌落至高氏一号培养基上划线纯化，得到本发明菌株。
其中，添加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基配方为可溶性淀粉20g、KNO3 lg、 K2HPO4 O. 5g、MgS04.7H20 0. 5g、NaCl 0. 5g、FeSO4. 7H20 0. Olg、琼月旨 20g、水 lOOOmL、pH7. 2，加入的抑菌剂(K2Cr2O7) 3mL。
实施例2
将本发明菌株CZB40接种5% (体积)于发酵培养基(玉米粉25g、酵母粉5g、MgSO4 0.2g、NaCl O. 8g, K2HP O4 O. 4g、1000ml 水；pH6)，28°C 下以 200r/min 转速摇瓶发酵培养 72h，用细菌过滤器(直径=0. 22 μ m)过滤，得发酵液。
实施例3本发明菌株对水稻纹枯病菌的抑制作用
于培养皿中加入3ml本发明菌株发酵液与12mlPDA，混匀制成平板(以3ml无菌水与12mlPDA混匀制成平板做对照)，将培养在PDA上的水稻纹枯病菌的小菌饼(直径=5mm) 倒置放到平板中央，重复3次。静置Ih后放入28°C温箱倒置培养l-2d。用十字交叉法测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度，记录结果并按下式计算抑制率
菌落直径=相垂直的两直径的平均值一菌饼直径
抑制率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼直径)X 100%。(这里提及的菌饼直径皆是指水稻纹枯病菌的小菌饼(直径=5mm))
结果表明本发明菌株的抑菌率为89. 3%，说明了本发明菌株对水稻纹枯病菌的生长有较强的抑制作用，并能抑制水稻纹枯病菌菌核的形成。
实施例4本发明菌株对辣椒疫霉病菌的抑制作用
参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为辣椒疫霉病菌，结果表明本发明菌株对辣椒疫霉病菌的抑制率为52. 94%，有较好的抑菌效果。
实施例5本发明菌株对桃树褐腐病菌的抑制作用
参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为桃树褐腐病菌，结果表明本发明菌株对桃树褐腐病菌的抑制率为80. 29%，有较好的抑菌效果。
实施例6本发明菌株对水稻稻瘟病菌的抑制作用
参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为水稻稻瘟病菌，结果表明本发明菌株对水稻稻瘟病菌的抑制率为52. 94%，抑菌效果较好。
权利要求
1.一种极暗黄链霉菌，其特征在于该菌株为极暗黄链霉菌(Streptomycesfulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO M2012519o
2.一种发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于发酵所用菌株为权利要求I所述的极暗黄链霉菌CZB40，发酵培养基为玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgSO4O.2-lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、水 1000ml，pH 5-9 ;发酵条件为接种量 1_10%、温度26-30°C、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48_96h。
3.如权利要求2所述的发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于所述培养基为:1000ml 培养基中 25g 玉米粉、5g 酵母粉、O. 2g MgSO4、0· 8gNaCl 及 O. 4gK2HP04 pH6 ;发酵条件为接种量5%、温度29°C、转速200r/min、发酵时间72h。
4.如权利要求2或3所述方法得到的发酵液。
5.如权利要求I所述的菌株在抑制水稻纹枯病中的应用。
6.如权利要求I所述的菌株在抑制辣椒疫霉病菌中的应用。
7.如权利要求I所述的菌株在抑制桃树褐腐病菌中的应用。
8.如权利要求I所述的菌株在抑制水稻稻瘟病菌中的应用。
全文摘要
一种极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM2012519。本菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，对水稻纹枯病菌的抑制效果尤为明显。
文档编号C12R1/465GK102978144SQ20121056618
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者朱宏建, 刘双清, 周清明, 何龙 申请人:湖南农业大学