专利名称：玫瑰黄链霉菌的一个负调控基因及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus) Men-myco-93-63 的 nsdBmgh 基因、制备方法及其应用。
背景技术：
棉花黄萎病被称为棉花上的“癌症”，作为一种典型土壤传播病害，其防治始终是世界性难题，至今既无高抗品种，又无理想的防治方法。黄瓜白粉病是生产上另一重要的真菌性植物病害，俗称白毛，全国各地都有发生，是保护地黄瓜的主要病害之一，除危害黄瓜外，还危害西葫芦、南瓜、甜瓜、冬瓜、西瓜和丝瓜等多种葫芦科作物。番茄灰霉病是由葡萄孢属引起的真菌性病害，主要危害番茄、黄瓜、韭菜、葡萄、草莓等多种蔬菜、果树及观赏植物，是一种毁灭性病害。目前生产上主要采用三唑类、嘧啶胺类等杀菌剂防治白粉病、灰霉病，但化学药剂使用时间长、用量大，病菌容易产生抗性，而且生食瓜果中的农药残留还会直接危害人体健康。随着人们环保意识的增强，生物防治因其对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用。采用生物制剂防治黄萎病、白粉病、灰霉病等病害，被认为是控制生产上主要病害最切实有效的方法，具有广阔的应用前景。目前，本研究小组已经独立发现并从土壤中分离得到生防链霉菌菌株 Men-myco-93-63，而且在室内及大田实验中，已经证实该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌、番茄灰霉病菌、瓜类白粉病菌等十几种重要植物病原菌的生长均表现很强的抑制作用(Liu D Q, Anderson N A, Kinkel L L. Selection and characterization of Streptomyces suppressive to the potato scab pathogens. Canadian Journal of Microbiology, 1996，42(5) : 487-502 ；刘大群，杨文香，祁碧菽，等.拮抗链霉菌 Men-myco-93-63及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响.河北农业大学学报，1999， 22(4): 79-82;郭敬华，孟庆芳，李亚宁，等.玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵液对黄瓜白粉病抗性的影响[J].华北农学报，2007，22 (s)，Γ4.；孟庆芳，张汀，刘大群.番茄灰霉病生防菌的筛选与研究[J].中国生物防治，2005，21:13纩144.)。由中科院微生物所经16S r RNA序列分析及120bp的、可变区BLAST比较，结合形态学及生理生化特征分析，将该菌株鉴定玫瑰黄链霉菌(Sti^ptomyces roseoflavus)(中科院微生物微检2005 年AOOl号)。另外，本研究小组已在Men-myco-93-63菌株中克隆得到了 nsdAmgh基因(沈凤英，刘力强，吴伟刚，等.玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63负调控基因nsdAmgh的克隆及序列分析.华北农学报，2009，24(5): 77-80)，试验表明，阻断该负调控基因后，突变株在摇瓶水平上对棉花黄萎病菌的抑制能力提高了一倍(沈凤英.玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63接合转移体系及nsdA基因的研究.河北农业大学，硕士学位论文， 2009)。基于上述研究成果，本发明人进一步深入研究Men-myco-93-63菌株，得到一种负调控基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因。本发明的第二个目的在于提供上述玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因的制备。本发明的第三个目的在于提供上述玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因的应用。本发明人经过研究对比发现，在天蓝色链霉菌中发现的/^必基因同M说基因结构相似，都含有TPR结构。/^必可能编码含有502个氨基酸的调控蛋白，该蛋白与灰色链霉菌产袍蛋白nrsA的5 个氨基酸有27. 9%的一致性，与as说的491个重叠氨基酸有似％ 的一致性。阻断/^必基因能够使菌株的放线紫红素和钙依赖抗生素产量均提高，但形态分化没有明显变化。因此，本发明人根据天蓝色链霉菌A3G)抗生素代谢途径中重要的负调控基因 nsdB的序列自主设计引物Ns8F和Ns8R，扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA， 得到了 1121bp的片段。非特异性引物锚定PCR方法(Nonspecific Anchored PCR, NPA-PCR)是基于随机引物PCR的原理，由彭华正的抑制序列非特异锚定PCR染色体步移方法改进而来。非特异性引物锚定PCR (NPA-PCR)中共用到四条引物，两条随机引物，SAPl (Sequence Anchoring Primer)和SAP2，SAP 2是SAPl的一部分，起到非特异性锚定的作用；基因特异性引物 GSPl (Gene Specific Primer)和 GSP2，GSPl 为外引物，GSP2 为内引物。NPA-PCR 包括四轮反应。第一轮反应通过一个低严谨性循环使得引物SAPl非特异地结合到变性DNA上。第一轮反应结束后加入GSP1，第二轮反应即SAPl和GSPl的扩增反应，以筛选第一轮反应中正确的结合子。非特异性扩增序列由于两端接合的同样引物在退火时形成茎环结构，产生 PCR抑制效应，被稀释消除。第三轮PCR是往第二轮反应产物中加入SAP2，扩增反应在引物 SAP2、GSP1之间进行，富集模板量。稀释的第三轮产物作为第四轮反应模板加入SAP2、GSP2 进行扩增，扩增得到片段即为目的片段。在设计引物Ns8F和Ns8R扩增Men-myco-93-63基因组DNA得到1121bp片段的基础上，我们利用非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)方法对该靶序列两端进行延伸，5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到长度为2073bp的基因全长序列，并在拼接序列两端设计引物验证延伸的正确性，比对发现扩增结果与拼接序列一致。该全长序列包含一个完整的开放阅读框，共编码464个氨基酸，与天蓝色链霉菌A3 O)中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，将该新基因命名为nsdBmgh新基因的制备为进一步研究和探明玫瑰黄链霉菌抗生素合成代谢途径和调控机理提供了又一重要依据，为抗生素高产基因工程菌株的获得奠定了重要基础。根据上述实验过程，本发明提供了所述玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因，其序列如下
CCTGAGACCTATTACCGCCCAGAGGATCTCCGTGTTGTGTGCATGGGCGATACAGATCCCTTCGTGTGCCTG TTGCATTGCGTGCACCTCCCGGCCCGGCCGCTTTCGGGTGCACCCTGGGGAGTGCCTTGCGGCGACCGGGTCGGGGTGGCGCACTCCTACCTGACACCCGGGGCCCCCTGGCACACCATCTGGCGCACCCTGGCGAACCCTGGCGAATAGTCGC TCAGCAACTGACAGGCGGTTACTGTCAACTCAGCCGAGAACCTGGGGGCTTGACGTGAACGGACAACCCAACACCCG CCTTTCGGACCTGTTCGGCCTGGCCGGCTGGTCCAAGGGTGAGCTCGCGAGGCTGGTGAACCGGCAGGCGGCGGCCA TGGGCCATCCCCAGCTGGCCACCGACACCTCGCGGGTGCGGCGGTGGATCGACACGGGGGAGATCCCCCGCGATCCG GTGCCGCGGGTGCTGGCGGTCCTGTTCACCGAGCGTCTCGGCCGTGTCGTGACCACTGAGGATCTCGGTCTGGTCCG GCAGGGACGCCCAGGGAAGCGGCAGGGCGACGGGAGTGTGGAGCACCCCGACGGCGTGCCGTGGGCGCCCGAGCGGA CGGCCTCGGTCCTCACCGAATTCACGGGAATGGACCTCATGCTCAACCGACGCGGCTTGGTGGGCGCGGGCGCTGCG CTTGCCGCAGGCTCCGCGCTCAGCAGCGCCATGCAAGACTGGCTGCACGTCGACCCGGCCCTCGCGGCCGACGCCCC CCGTACCCACGACCCCCTGCACGTCGACCCCGCAGCCGCCGACCGCTACGAGGCCGCTCCCGTCGGCTCCCAGGAGA TCGAGGAGCTGGAGCGCTCGGTCGAGGTGTTCCGCGCCTGGGACGCGTCCCGCGGCGGCGGACTCCAGCGCAAGGCC GTGGTGGGCCAGCTCAACGAGGTGGGCGGCATGCTCGCCTACCGCCACCCCGACCACCTCCAGCGACGCCTGTGGGG CGTCGCCGCCAACCTCGCAGTCCTCGCCGGCTGGATGTCGCACGACGTCGGCCTCGAACCCACGGCGCAGAAGTACT TCGTCATCGCGGCGCACGCGGCGCGGGAGGGCGGGGACCGGCCGCGTGCCGGGGAGGCCCTGTCGCGGGCCGCGCGC CAGATGGTGCACCTCGGCAAGCCGGACGACGCCCTGGACCTGATGAAGCTGGCCAAGTCCGGCGGCGGTGAGGAGGC CCTGCCGCGCACCAAGGCCATGCTGTACACCATCGAGGCCTGGGCGCAGGCGTCGATGGGGCGCGGCCAGGCCATGC GGCGCACGCTCGGCCTCGCCGAGGACCTCTTCGTCTCCGACAAGGGGGACGTGGAGCCGCCGAGCTGGATGCAGATG TTCGACGAGGCGGACCTGCACGGCATGCAGGCCCTGGCCTACCGCACGCTCGCCGAACACGACCCGGCGGCGGCGAG CGTCGCGCAGCGGCACGCCAAACTCGCCATCGAGCTGCGGGCCAAGGGCCGCGACCGCTCGCAGATCTTCGACTACA TCTCGCTGGCCTCCGCCTGCTTCATCGCCGACGACCCGGAGCAGGCCGACCGCTACGCACGCCTGGCCCTGGTGTCG ATAAACTCCAACTCCTCCCACCGCACCTGGGACCGGCTGCGCGAGATGTTCCGACTGACCGCGCAGTACTCCGACTA CCCGAAGATCCAGGACCTGCGCGAGGAGATCAAGCTCGCGCTGCCGAAGGGGGTCAAGGCGGGAGGCAGGACGGCGA GGGCGTGACGCGCCCGTCCTGAACACCGGCCCGAGCCCGTCCTCACCACCGAACCGAGGGCGACCGGCCGGACCGTG TCGTCAGGCGCGGGTCACACCCGTGCCATCAGCAGACAGGCGTCGGCCTCACGCGGCACCTCGTCGAACGCCTCCAT GACGGCGCGCACGCAGTCCTGCGCGTTGAGCGCCCCGGTGAAGCGGGGTGCCATCGAGAGAAGTTCGGTCGTGGCCG CGTCCCGGTCGCACCGGGGGACCAGACCGTCGATGCAAAAAACACGGAGATCCTCTGGGCGGTAATAGGTCTCAGG
根据上述实验过程，本发明还提供上述玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 /^0 ^基因的制备方法。所述制备方法是以玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到1121bp的片段，利用非特异引物锚定PCR(NPA-PCR)方法对该靶序列两端进行延伸， 5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到长度为2073bp的全长序列，并在拼接序列两端设计引物验证延伸的正确性，比对发现扩增结果与拼接序列一致。该序列包含一个完整的开放阅读框，共编码464个氨基酸，与天蓝色链霉菌A3 O)中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，将该基因命名为具体的说，本发明所述的制备方法包括以下步骤
1)玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因部分片段的获得根据国际基因库
(GenBank)上天蓝色链霉菌nsdB基因(GenBank登录号11(^690 ；编号为SC0725》的序列设计一对特异引物 Ns8F (GTGGATCGACATGGGAGAGAT )和 Ns8R (CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT )， PCR扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA ；PCR产物电泳检测，然后将PCR产物连接到克隆载体PMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行测序；
2)玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 /^0 ^基因5’端和3’端非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)根据步骤1)中PCR的测序结果，设计5’端非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)特异性引物 GSPl (GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA)和 GSP2 (CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG)；3‘端非特异引物锚定 PCR (NPA-PCR)特异性引物 GSP3 (GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG)和 GSP4 (GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG)，进行非特异引物锚定PCR扩增；PCR产物电泳检测，然后将 PCR产物连接到克隆载体PMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行测序。其中，所述步骤1)是，PCR反应体系为模板DNA 50 ng, LA Taq酶1 U,5 μ mol · L-I 的上、下游引物各 0. 5 μ L, 10 mmol · L-I 的 dNTP 1 μ L，2XGC buffer I 缓冲液12. 5 μ ，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 μ L ;PCR反应程序为先95°C 5 min ；然后 940C 1 min, 600C 1 min，72°C 1 min30s，共；35 个循环；最后 72°C 10 min，4°C保存；
随后PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体 PMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3 个阳性克隆进行测序，在国际基因库(GenBank)上进行序列分析获得nsdBmgh基因的部分片段序列。步骤2)所述非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)扩增体系和程序为
第一轮反应为15 μ L体系包含1 U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、 10 μ L 2XGC buffer Ι、0· 1 μΜ SAPl (非特异引物锚定PCR通用引物)，用无菌蒸馏水补充反应体系至15 UL0 PCR反应程序为94°C 5 min, 30°C 3 min，以0. 2°C / s升到65°C， 65°C 5 min。第二轮反应为向第一轮反应体系中加入5 μ L引物GSPl (5’端延伸所用引物)或 GSP3 (3，端延伸所用引物)(终浓度为0.5 μΜ)。PCR反应程序为94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 个循环；72°C 5 min。第三轮反应为向第二轮PCR产物中另加2. 5 yL SAP2(非特异引物锚定PCR)(终浓度为 0.5 μΜ)和 2. 5yL 2XGC buffer I。PCR 反应程序为先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 个循环；72°C 5 min。第四轮反应以1 μ L 50倍稀释的第三轮产物为模板进行扩增，反应体系为0.5 μΜ GSP2(5’端延伸所用引物)或GSP4 (3’端延伸所用引物)，0.5 μ M SAP2,0. 2 μΜ dNTPs，2XGC buffer I 禾口 IU LA Taq 酶。PCR 反应程序为先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 30 个循环；72°C 5 min，4°C保存。随后，将PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，PCR产物连接到克隆载体 PMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3 个阳性克隆进行测序，在国际基因库(GenBank)上进行序列分析获得基因的5’端和 3’端基因序列。另外，本发明所述的制备方法，在步骤2)之后，还包括步骤^nsdBmgh基因全长序列的验证。步骤3)是根据步骤1)中获得的测序结果与步骤B中5’端和3’端的延伸结果进行序列拼接，设计一对特异引物I3R (ACGACCGAACTTCTCTCGATGG)和PF(ATACAGATCCCTTCGTGTGCCTGT)进行PCR扩增验证拼接结果的正确性。其中，所述PCR反应体系为模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U, 5 μ mol · L-1的上、下游引物各0. 5 μ L，10 mmol · L-I的dNTP 1 μ L，2 X GC buffer I缓冲液12. 5 μ ，用无菌蒸馏水补充反应体系至 25 μ L ;PCR 反应程序为先 95°C 5 min ；然后 94°C 1 min，65°C 1 min，72°C 3 min，共；35 个循环；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR 产物按上述方法进行克隆，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因库(GenBank)上进行序列分析。经过比对发现，扩增结果与拼接序列一致。该序列包含一个完整的开放阅读框，共编码464个氨基酸，与天蓝色链霉菌A3 O)々nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，将该基因命名为nsdBmgh。禾Ij 用 InterPro database 数据 (http//www. ebi. ac. uk/interpro/)对 Men-myco-93-63中克隆到的nsdBmgh基因编码的氨基酸序列进行分析，发现其与天蓝色链霉菌A3(2) WnsdB基因编码的NsdB蛋白在结构域组织方式上相同，都具有TPR结构域，表明玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中克隆到的nsdBmgh基因很可能起着与天蓝色链霉菌中的nsdB基因类似的功能，即在菌株代谢途径中起到负调控作用。链霉菌是好氧的革兰氏阳性细菌，能产生多种次级代谢物并且经历复杂的形态分化，有很多基因已被确认在形态分化中充当重要的角色。研究发现这些基因的表达产物均含有类TPR结构。TPR是一个含有34个氨基酸的蛋白重复序列，编码α螺旋-转角-α螺旋的二级结构片段，通常以串连形式重复出现在蛋白结构中，参与蛋白间的相互作用和细胞内的功能调节(Gaisser S, Bohm G A, Cortes J, et al. Analysis of seven genes from theeryAI-eryKregion of the erythromycin biosynthetic gene cluster in Streptomyces erythraeus. MolGen Genet, 1997, 256(3): 239-251)。天蓝色链霉菌中就预测有70个含类TPR结构的蛋白，其中包括负调控基因nsdB。nsdB基因目前只在天蓝色链霉菌中被研究和报道，发现阻断该基因会使菌株的放线紫红素和钙依赖抗生素产量提高，菌株形态分化没有明显变化(Zhang L, Li W C, Zhao C H, et al. NsdB, a TPR-Iike-domain-containing protein negatively affecting production of antibiotics in Streptomyces coelicolor A3(2). Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47(5):84054)0本试验发现玫瑰黄链霉菌的nsdBmgh基因编码的氨基酸序列与天蓝色链霉菌的nsdB基因编码的NsdB蛋白的结构域相同，都含有TPR结构，因此推测 nsdBmgh基因在玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中也可能起到重要的负调控作用。因此，本发明提供的玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的nsdBmgh基因可用于对该生防菌的遗传改造，通过阻断该负调控基因使菌株产生抗生素能力提高，以适用于生防菌株的工业化生产。对负调控基因的研究对生产菌株的超量表达和开发新的有实际应用价值的抗生素具有重要的理论和实践意义。将有利于改良抗生素生产菌株及进行新型抗生素的研发，为改造链霉菌抗生素生物合成相关基因、提高菌株抗生素产量提供理论依据，还将有助于发现新的有价值的天然产物。本发明利用非特异性引物锚定PCR (NPA-PCR)方法制备了玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63的一个新的负调控基因aso _。玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63菌株及其发酵液对不同致病力的棉花黄萎病菌及其它十几种植物病原菌的生长均表现较强的抑制作用。本发明中得到的^基因将为玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中进一步研究和探明该生防菌抗生素合成代谢途径和调控机理，以期获得抗生素高产的基因工程菌株提供重要依据。
图1是对天蓝色链霉菌M145和玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdB基因的PCR 扩增结果；
图2是用NPA-PCR方法对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdBmgh基因5’端进行延伸的结果；
图3是用NPA-PCR方法对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdBmgh基因3’端进行延伸的结果；
图4是验证拼接序列正确性的PCR扩增结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如无特别指明，实施例中采用的原料均为市购，其中所述玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63购自河北农大生防实验室，天蓝色链霉菌M145购自中国科学院微生物所；基因组DNA的制备参见文献=Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning: a laboratory mannual(3rd Edition). Cold Spring Harbor, New York: Cold spring Harbor Laboratory Press.2001)。本发明以玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到 1121bp的片段，利用非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)方法对该靶序列两端进行延伸，5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到长度为2073bp的全长序列，随后在拼接序列两端设计引物验证延伸的正确性，比对发现扩增结果与拼接序列一致。该序列包含一个完整的开放阅读框，共编码464个氨基酸，与天蓝色链霉菌A3 (2) 中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，将该基因命名为如前所述，具体的说，本实施例中的玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 /^0 ^基因序列的制备方法为
k、nsdBJa基因部分片段的获得；
Bj1S0Si^基因5’端和3’端非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)； LnsdBmgh基因全长序列的验证。步骤A是根据国际基因库(GenBank)上天蓝色链霉菌aso 基因(编号为SC07252) 的序列设计一对特异引物Ns8F和Ns8R，扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA(对照菌株为天蓝色链霉菌M145)，
PCR反应体系为模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U, 5 ymol 'L-I的上、下游引物各0.5 UL, 10 mmol · L-I的dNTP lyL,2XGC buffer I缓冲液12. 5 μ ，用无菌蒸馏水补充反应体系至 25 “1^屮0 反应程序为先951 5 min;然后 94°C 1 min,60°C 1 min，72°C 1 min30s，共35个循环；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，检测结果如图1所示(M为DL2000 marker，1是以M145基因组为模板，2是以 Men-myco-93-63基因组为模板)。将PCR产物连接到克隆载体pMD19_T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，结果得到长度为1121bp的片段。在国际基因库(GenBank)上进行序列分析，与天蓝色链霉菌nsdB 基因的核苷酸序列同源性为86%。步骤B是根据步骤A中PCR的测序结果，设计5’端非特异引物锚定PCR(NPA-PCR) 特异性引物GSPl和GSP2 ；3’端非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)特异性引物GSP3和GSP4。 非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)扩增体系和程序为
第一轮反应为15 μ L体系包含1 U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、 10 μ L 2XGC buffer Ι、0· 1 μΜ SAPl (非特异引物锚定PCR通用引物)，用无菌蒸馏水补充反应体系至15 yL。PCR反应程序为94°C 5 min,30°C 3 min，以0. 2°C/ s升到65°C， 65°C 5 min。第二轮反应为第一轮反应体系中加入5 μ L引物GSPl (5’端延伸所用引物)或 GSP3 (3，端延伸所用引物)(终浓度为0.5 μΜ)。PCR反应程序为94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 个循环；72°C 5 min。第三轮反应为第二轮PCR产物中另加2. 5 μ L SAP2 (非特异引物锚定PCR)(终浓度为 0.5 μΜ)和 2. 5yL 2XGC buffer I。PCR 反应程序为先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 个循环；72°C 5 min。第四轮反应以1 μ L 50倍稀释的第三轮产物为模板进行扩增，反应体系为0.5 μΜ GSP2(5’端延伸所用引物)或GSP4 (3’端延伸所用引物)，0.5 μ M SAP2,0. 2 μΜ dNTPs，2XGC buffer I 禾口 IU LA Taq 酶。PCR 反应程序为先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共30个循环；72°C 5 min，4°C保存。PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，5，端检测结果如图2，3’端检测如图3 (其中M为DL2000 marker，1和2为 Men-myco-93-63)。将PCR产物按上述方法进行克隆，挑取3个阳性克隆进行测序并在国际基因库(GenBank)上进行序列分析。结果为5，端延伸，扩增得到534bp的片段，与nsdB基因核苷酸序列同源性为91%。3’端延伸，扩增得到702bp的片段，与nsdB基因核苷酸序列同源性为81%。步骤C是根据步骤A中获得的测序结果与步骤B中5’端和3’端的延伸结果进行序列拼接得到2073bp的全长序列。设计一对特异引物I3R和PF进行PCR扩增验证拼接结果的正确性。PCR反应体系为模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U, 5 μ mol *L-1的上、下游引物各 0.5 yL, 10 mmol .L-I 的 dNTP lyL,2XGC buffer I 缓冲液 12. 5 μ ，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 4 1^屮0 反应程序为先951 5 min;然后94°C 1 min，65°C 1 min, 72°C 3 min，共35个循环；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物按上述方法进行克隆，挑取3个阳性克隆进行测序。该引物对在玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中预期片段为194!3bp，电泳显示扩增条带大小与预期相符，如图4所示(M为DL2000 marker, 1为Men-myco-93-63)。在国际基因库(GenBank)上进行序列分析发现扩增结果与拼接序列一致，说明拼接结果正确。具体的说，上述制备方法中采用的各引物序列见表1
表1制备玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因的引物序列
引物名称序列(5’ to3')Ns8FGTGGATCGACATGGGAGAGATNs8RCCATGGACAGGTAGTCGAAGAT
权利要求
1.一种玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 /^oB:基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO :1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列。
2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述基因的载体，或进一步包括含有该载体的宿主。
4.权利要求1所述基因在制备转基因植物或在提高植物抗虫活性中的应用。
5.权利要求2所述蛋白在制备生物杀虫剂或在杀灭植物害虫中的应用。
6.一种制备权利要求1所述基因的方法，包括如下步骤1)玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因部分片段的获得根据GenBank 登录号11(^690的天蓝色链霉MnsdB基因的序列设计一对特异引物NsSF GTGGATCGACATGGGAGAGAT 和 Ns8R CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT, PCR 扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63基因组DNA ；PCR产物电泳检测，然后将PCR产物连接到克隆载体pMD19_T 上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行测序；2 )玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因5 ’端和3 ’端非特异引物锚定 PCR:根据步骤1)中PCR的测序结果，设计5’端非特异引物锚定PCR特异性引物GSPl GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA 和 GSP2 CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG ； 3，端非特异弓丨物锚定 PCR 特异性引物GSP3 :GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG和GSP4 GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG,进行非特异引物锚定PCR扩增；PCR产物电泳检测，然后将PCR产物连接到克隆载体PMD19-T上， 并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行测序。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR反应体系为模板 DNA 50 ng, LA Taq 酶 1 U，5 μ mol · L-I 的上、下游引物各 0. 5 μ L, 10 讓ol ·厂1 的 dNTP lyL,2XGC buffer I缓冲液12. 5 μ ，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 yL;PCR反应程序为先 95°C 5 min;然后 94°C 1 min,60°C 1 min，72°C 1 min30s，共；35 个循环；最后 72°C 10 min，4°C保存；随后PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体 PMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3 个阳性克隆进行测序，在国际基因库上进行序列分析获得nsdBmgh基因的部分片段序列。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述非特异引物锚定PCR (NPA-PCR)扩增体系和程序为第一轮反应为15 μ L体系包含1 U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、 10 μ L 2XGC buffer I、0. 1 μ M SAP1，用无菌蒸馏水补充反应体系至15 yL;PCR反应程序为94°C 5 min, 30°C 3 min，以 0. 2°C / s 升到 65°C，65°C 5 min ；第二轮反应为向第一轮反应体系中加入5 μ L引物GSPl或GSP3，其终浓度为0.5 μΜ； PCR 反应程序为94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 个循环；72°C 5 min ；第三轮反应为向第二轮PCR产物中另加2. 5 yL SAP2，其终浓度为0. 5 μΜ和2.5yL 2XGC buffer I ；PCR 反应程序为先 94°C 2 min;然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 个循环；72°C 5 min ；第四轮反应以1 PL 50倍稀释的第三轮产物为模板进行扩增，反应体系为0.5 μΜ GSP2 或 GSP4, 0.5 μΜ SAP2,0. 2 μ M dNTPs，2XGC buffer I 禾口 IU LA Taq 酶；PCR 反应程序为先 94°C 2 min;然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 30 个循环；72°C 5 min，4°C保存；随后，将PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，PCR产物连接到克隆载体 PMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养过夜，挑取3 个阳性克隆进行测序，在国际基因库上进行序列分析获得基因的5’端和3’端基因序列。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)之后，所述的制备方法还包括步骤1^nsdBmgh基因全长序列的验证。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤3)是根据步骤1)中获得的测序结果与步骤Β中5’端和3’端的延伸结果进行序列拼接，设计一对特异引物ra: ACGACCGAACTTCTCTCGATGG和 PF :ATACAGATCCCTTCGTGTGCCTGT 进行 PCR 扩增验证拼接结果的正确性；其中，所述PCR反应体系为模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U,5 ymol*L_l的上、 下游引物各 0. 5 μ L, 10 mmol · Γ1 的 dNTP 1 μ L，2 XGC buffer I 缓冲液 12. 5 μ ，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 “1^屮0 反应程序为先951 5 min;然后94°C 1 min,65°C 1 min,72°C 3 min，共35个循环；最后72°C 10 min，4°C保存；PCR产物在的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物按上述方法进行克隆，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因库上进行序列分析。
全文摘要
本发明涉及玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)Men-myco-93-63的nsdBmgh基因、制备方法及其应用。本发明以天蓝色链霉菌A3(2)抗生素代谢途径中重要的负调控基因nsdB的序列自主设计引物Ns8F和Ns8R，扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA,得到了1121bp的片段；随后利用非特异引物锚定PCR(NPA-PCR)方法对该靶序列两端进行延伸，获得玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63nsdBmgh基因。nsdBmgh基因的制备为进一步研究和探明玫瑰黄链霉菌抗生素合成代谢途径和调控机理提供了又一重要依据，为抗生素高产基因工程菌株的获得奠定了重要基础。
文档编号C12N15/82GK102212533SQ20111009622
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者冀红柳, 刘大群, 孟庆芳, 张娜, 张汀, 张立荣, 李亚宁, 李星 申请人:河北农业大学