专利名称：超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法
技术领域：
本发明涉及一种植物基因转化方法，特别是一种利用超声波处理划伤和农杆菌介导直接转化植物萌发种子，不需要组织培养过程的新方法。
背景技术：
在专利号为ZL 01104185. 4的中国专利中公开了一种利用农杆菌直接转化玉米萌发种胚的转基因方法，该发明是一种利用农杆菌介导植物萌发种子进行基因转化的方法，即以植物萌发种子为受体材料，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因供体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使其将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。 该法以植物萌发种子为受体，避开了繁冗、操作要求高的植物组织培养过程，同时，利用种子作为受体，获得的转化植株和种子的周期性大大缩短，并且种子取材方便，不受季节限制。但该方法的主要缺点是转化率较低，仅有0. 6%左右，并且容易形成嵌合体。在中国发明专利ZL 91103622. 9和ZL 97111924. 4中，许宁等公开了用超声波处理植物组织块进行基因转化的方法。他们使用的植物组织块为叶片、愈伤组织或幼胚，处理后仍需经过组织培养过程才能获得完整的转化植株和种子。孙毅等提出了一种超声波处理花粉诱导基因转移的方法(中国专利ZL9912115. 2)。该方法是将植物新鲜花粉放入含有外源DNA缓冲液的容器中，用超声波处理溶液，在脉冲超声波的作用下，将外源基因导入植物花粉中。以上这些发明都说明，采用超声波处理可以使植物处于感受态，并有利于外源DNA 的进入。在这些发明中，所使用的都是质粒DNA，它们是靠渗透作用进入植物细胞的。
发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种直接以植物萌发种子作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生过程的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法。本发明的具体技术方案是以划伤萌发幼胚后进行超声波处理的萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA 进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。为利于农杆菌Ti质粒进入到受体细胞中，对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养，将植物萌发种子生长点部位划伤后立即进行超声波处理，使其顶端分生组织细胞处于感受态。所用超声波的功率100-900W，频率10秒/次，处理次数为1-10次。胚是植物的雏形，胚部的顶端分生组织细胞具有旺盛分裂的能力，用刀片划伤萌发种子胚生长点时，划得太深会使生长点部位受伤过重，其细胞分裂能力下降甚至死亡；而划伤太浅则生长点部位未受伤，其细胞很难被农杆菌侵染，因此划伤应适度。划伤深度随作物种与品种不同而略有差异，一般为l_3mm，在玉米自交系昌7-2上划伤深度约为2mm。(再具体一点)。同时，在对萌发种子生长点部位进行人为划伤的基础上，进行超声波处理可以使生长点细胞处于感受状态，进一步提高转化率并减少嵌合体的形成。根据前人的研究结果，那些易被农杆菌转化的双子叶植物通常可在感染处分泌出一种酚类物质——乙酰丁香酮，该物质可激活农杆菌Ti质粒上的Vir基因，从而促进农杆菌侵染和对受体的转化。因此当受体为农杆菌宿主植物叶芽时，可直接被农杆菌侵染和转化；当受体为非农杆菌宿主或单子叶植物叶芽时，可在农杆菌悬浮液中加入一定量的乙酰丁香酮作为农杆菌侵染诱导物。在本发明中，对划胚和超声波处理后的植物萌发种子经农杆菌侵染和共培养；植物萌发种子与农杆菌的共培养是在浓度为106-108cfu/ml的农杆菌液中进行，并在菌液中加入终浓度为10-200umol/L乙酰丁香酮。在萌发种子与农杆菌共培养后，可以直接播种于苗床中，将共培养后(无论是否经过初筛)的萌发种子播种于苗床中继续进行筛选。或置于含筛选剂的水溶液中进行初步蹄选。筛选方法可以是根据外源基因载体所携带的选择标记基因使用相应的筛选剂，或者采用分子检测方法，如PCR扩增或Southern杂交。对检测阳性的植株进行自交或杂交获得转基因TO代种子，将获得的TO代转基因种子播种，获得Tl代转基因植株，并在此后继续进行自交和分子检测，直至获得稳定纯合的转基因自交系或品种。获得的自交系或品种可以用作配制杂交种的亲本或用作杂交育种的亲本。本发明通过对萌发种子生长点部分进行划伤和超声波处理后作为农杆菌侵染受体。在将农杆菌与处理后的萌发种子共培养一段时间后，然后对种子进行直接筛选，不需进行组织培养和植株再生。通过超声波处理也可以使萌发中的幼胚分生组织细胞处于感受状态，从而有利于农杆菌感染，比其他的植物基因转化方法更为简便、快速、经济。在传统的农杆菌介导的基因转化中，可以通过在培养基中加入筛选标记来淘汰未转化细胞，本发明受此启发在种子与农杆菌共培养48小时后，将其置于含有一定浓度筛选剂的溶液中筛选，然后进行播种。实验证实采用农杆菌介导植物萌发种子基因转化后，外源基因已整合到受体植物基因组中。利用植物萌发种子作为农杆菌介导外源基因转化的受体系统，避开了传统农杆菌共培养法所要求的严格繁冗的组织培养过程，缩短了实验周期， 且在种子萌发过程中就进行筛选，可以有效地淘汰未转化苗数，减少后期检测的工作量，并节省土地。本发明不需要昂贵的仪器及复杂的操作技术，且利用植物萌发种子作为受体，取材方便，不受季节限制；本方法操作简单，一次可处理大量种子。采用本发明已成功对玉米、 高粱、小麦的萌发种子进行了遗传转化。
图1为质粒CrylAc的物理图谱；图2为将萌发种子沿胚芽生长方向纵向划伤后的划伤部位图。图中1、种皮或果皮，2、胚乳，3、胚芽鞘，4、胚芽，5、子叶，6、胚根，7、胚根鞘。
具体实施例方式实施例1.基本转化方法1)以携带有质粒CrylAc的农杆菌LBA4404为外源基因供体。质粒CrylAc携带有苏云金芽孢杆菌毒蛋白AC基因和植物筛选标记基因bar，它赋予植物对除草剂kista (有效成分为Wiosphiothricin或PPT)的抗性。此基因构建由中国农科院作物科学研究所王国英研究员提供。质粒CrylAc的物理图谱如图1所示。2)以玉米(Zea mays L.)自交系昌7-2和郑58、高粱恢复系晋粱5号、小麦品种晋作239等为受体材料。3)转化操作过程首先将供试种子在自来水中漂洗后，置于75%乙醇中30秒，然后在超净工作台中用无菌蒸馏水漂洗3次后放于玻璃容器无菌水中(水的高度以略微超过种子为宜)，用高压灭菌后的纸或封口膜盖好，置于室温下OO-^rc)摇床上(100-200转 /分钟)24-48小时。在种子胚芽部分突起(俗称“露白”)后，用解剖刀将萌发种子沿胚芽生长方向纵向划伤(划伤部位见图2、后立即进行超声波处理。超声波处理强度为300、600 和 900ffo在含有50mg/L卡那霉素(Km)和20mg/L利福平(rif)的LB平板挑取含以上基因的农杆菌单菌落，接种于IOmL含有50mg/L Km和20mg/L rif的LB培养基中，28°C，180r/ min过夜培养至对数中期(0D600约为0. 4-0. 6)并加入终浓度为100 μ mol/L乙酰丁香酮。 将以上经划伤和超声波处理的萌发种子，在每350mL划伤种子培养液中加入10-50mL含 106-108Cfu/mL的农杆菌液，在120-150r/min下振荡培养10-12小时后，倾去多余菌液，再加入等量蒸馏水，并置于摇床上，继续进行振荡共培养。本实验中还设有一个在此时向培养液中加入0.01%筛选剂kista的处理。光照为12小时，保持温度观！。再经过2天的共培养后，将发芽的种子播种于沙土中进行筛选培养，并在一周左右用0. 的除草剂basta 作为筛选剂喷施到幼苗叶片上。经过1-3周的选择，取生长健壮、发育良好的basta抗性植株移入大田。对移入大田的幼苗进行正常生长管理，在开花时套袋自交，并在籽粒成熟时收
-M-犾。实施例2.转基因植株的分子检测转基因植株的分子检测根据《分子克隆手册》进行1)本实验中，植物总DNA的提取采用CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)法，用琼脂糖凝胶电泳检查DNA提取结果和进行DNA定量。根据CrylAc和bar基因的核苷酸序列，分别取5’端和3’端20bp的核苷酸对设计引物，进行PCR扩增。引物序列及其扩增片段大小如下CrylAc 基因上游引物5，-CTGACCGTGACCGTGCTG-3，下游引物5，-TGGTGCCGTAGGCGAACT-3，.扩增片段大小500bpBar 基因上游引物5，-GTCTGCACCATCGTCAACC-3，下游引物5，-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3，.扩增片段大小20Ibp引物由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增用大连宝生物公司的TaKaRahqTM 试剂盒和PTC-200型PCR仪完成。将经过转化处理和抗性筛选得到的植株取叶片，提取总 DNA和PCR扩增。扩增程序根据引物序列予以调整。2) Southern杂交为进一步证实PCR扩增结果的可靠性，随机取PCR扩增阳性植株叶片提取总DNA并进行Southern杂交，以质粒DNA为阳性对照，未转化株叶片DNA为阴性对照。结果表明，外源基因确已整合到玉米基因组中。实施例3.玉米遗传转化为了探讨多种因素对转化率的影响，设计了包含有划伤萌发种子、超声波处理和是否在共培养48小时后向培养液中加入筛选剂3个因素的实验。其中超声波处理还包括了 3个强度水平(300W、600W和900W)，对玉米自交系昌7_2进行了遗传转化，每一处理有 4次重复，每一重复用萌发种子500粒。所有处理共筛选出basta抗性植株1333株。将经 basta筛选的植株移入大田后，约80%以上的幼苗能正常成苗。开花时大部分植株表现正常，只有少部分植株出现花期不遇、不能正常散粉等变异。根据实施例2的方法对basta抗性株取叶片和提取总DNA进行分子检测，以确定转化率，总计获得1 株转化株。筛选和分子检测结果见表1。表1玉米种子基因转化处理后抗basta筛选和PCR检测结果
权利要求
1.一种超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在种子萌发过程中与农杆菌共培养，将外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA 进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。
2.根据权利要求1所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养；划伤深度随作物种与品种不同而略有差异，一般的划伤深度约为2-3mm ；所用超声波的功率100-900W， 频率10秒/次，处理次数为1-10次。
3.根据权利要求1所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对划胚和超声波处理后的植物萌发种子经农杆菌侵染和共培养；植物萌发种子与农杆菌的共培养是在浓度为106-108cfu/ml的农杆菌液中进行，并在菌液中加入终浓度为 10-200umol/L 乙酰丁香酮。
4.根据权利要求3所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是在萌发种子与农杆菌共培养后，直接播种于苗床中，或置于含筛选剂的水溶液中进行初步筛选。
5.根据权利要求4所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是将共培养后的萌发种子播种于苗床中继续进行筛选，筛选方法是根据外源基因载体所携带的选择标记基因使用相应的筛选剂，或者采用分子检测方法，如PCR扩增或Southern杂 、-父。
6.根据权利要求5所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对检测阳性的植株进行自交或杂交获得转基因TO代种子。
7.根据权利要求6所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是将获得的TO代转基因种子播种，获得Tl代转基因植株，并继续进行自交和分子检测，直至获得稳定纯合的转基因自交系或品种。
8.根据权利要求7所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是获得的自交系或品种用作配制杂交种的亲本或用作杂交育种的亲本。
全文摘要
一种超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其目的是直接以植物萌发种子作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生过程。本发明以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在种子萌发过程中对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养；将外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。
文档编号C12N15/84GK102212553SQ20111009585
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者于纪珍, 孙毅, 张丽君, 张婷婷, 杜建中, 杨丽艳, 王亦学, 王铭, 郝曜山 申请人:山西省农业科学院生物技术研究中心