专利名称：一种玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和现代酶工程技术领域，具体是一种玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用。
背景技术：
海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1,1糖苷键相连而成的非还原性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高渗)变化后造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，因此被誉为“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用，随着人类社会的发展和进步，希望能将海藻糖应用于日常生活所常用各类食品的鲜味保持与质地改善，更好提高人们的生活和健康水平，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。目前已经在多种微生物中分离到多种不同类型的海藻糖合成酶及其相关的基因，目前发现的海藻糖合成相关酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途径可以分为三种途径，第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成途径，主要由径6-磷酸海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase)禾口 6_ 憐酸海藻糖酉旨 (Trehalose-6-phosphate phosphatase)组成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖合成 6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖；第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶合成途径，主要是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen， MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase)组成，先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物，通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的α，α_1，4糖苷键转变成α， α-1，1糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下一个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖；第三种途径是海藻糖合成酶途径，与其它海藻糖合成途径不同是这种途径只有一种酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase, Tre S)组成，它作用的底物是麦芽糖(Maltose)，通过催化麦芽糖分子内转糖基，将α， α-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为α，α_1，1糖苷键，麦芽糖转变成海藻糖。第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖， 在生产成本很难产生竞争优势，第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有很强的竞争优势，第三种途径和第二种途径相比，第三种途径只需要一种酶，因此在利用基因工程菌生产酶时不需构建两种工程菌，在生产过程设备的占用率会更低，而且不需要考虑两种酶的反应条件是否一致，这样可以使生产工艺上会更简单，因而具有更强的竞争优势。目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因的相关酶用于制备海藻糖，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率，而且目前都还没有得到工业规模化的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，在转化麦芽糖生成海藻糖时能产生较高的海藻糖及产生较少的葡萄糖，并且在较广反应温度和PH范围内都能保持较高的酶活力，这样可以使海藻糖的生产工艺更容易控制。本发明人利用生物信息手段对GenBank中庞大的DNA序列和氨基酸序列资源进行同源性检索分析，对已经完成序列分析的上千种微生物的DNA序列进行大量核酸序列进行分析和对比，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是某功能蛋白质”的极为有用基因，推测该序列的功能，然后找到候选基因序列进行实验的功能鉴定，最终确定基因的功能和性质，其中包括至今为止人们并未发现的海藻糖合成酶基因 (treS)，并用这种合成酶基因经过克隆和进行重组表达，再利用重组表达的海藻糖合成酶用于转化麦芽糖生产海藻糖。本发明人在研究海藻糖合成酶的过程中，对玫瑰链霉菌(Str印tosporangium roseum)基因组序列进行同源检索分析，发现这一段尚未有文献报道其功能的DNA序列， 这段DNA序列在Genbank中被注释为“假定的海藻糖合成酶基因”(putative trehalose synthase)。经过分析这段DNA与已经有文献报道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有较高的同源性，同源性达到75%以上，而其编码的假定的蛋白质的氨基酸序列与已发表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸也有较高同源性，氨基酸同源性达到80%以上，所以很难通过氨基酸序列的对比分析确定其为何种酶，必须要经过具体实验来验证这段基因的功能是属于何种酶。本发明所述的海藻糖合成酶基因克隆自玫瑰链霉菌(Str印tosporangium roseum)，菌株编号为4. 1208)，该菌种可以从中国微生物保藏中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。玫瑰链霉菌(Str印tosporangium roseum)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量约为65. 74kD2、等电点约为PI = 4. 743、酶的最适反应温度为25 35°C，优选30°C4、酶的反应的pH在6. 5 7. 5，优选pH为7. 05、二价金属离子的浓度在5m mol/L时1 3+和K1+对酶活影响不大，而Ca2+、Mn2+和狗2+对酶活有轻微的抑制作用，Cu2+、Ba2+和Si2+对酶活有较强的抑制作用，其中Si2+对酶活的抑制最强烈。6、在pH7. 0和30°C最佳的反应条件下，反应1. 5h后产物中海藻糖含量最大达到 82%，葡萄糖5.6%，麦芽糖12.4%，随着反应时间的增加海藻糖和麦芽糖的含量都会减CN 102533822 A
少，而葡萄糖的含量会增加。本发明人所采用的实验方法，包括众所周知的聚合酶链式反应(PCR)技术；DNA的提取、酶切、连接等DNA分子操作技术，把这一段标记为假定的海藻糖合成酶基因的DNA序列连接到表达载体上，如pET5a、pSE380等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达， 经过细胞破碎，例如利用溶菌酶、超声波或机械碾磨法等破碎细胞后，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定其功能和酶学特性，证实了这一段“假定蛋白质”编码的是一种特性特征与前人发现的完全不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括了氨基酸序列和 DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最适反应温度最适pH不同，酶学特性不同，反应条件的不同以及酶对底物麦芽糖转化为海藻糖比例的差异等特性，因此判定是一种新的发现。本发明所述的海藻糖合成酶的基因是克隆玫瑰链霉菌(Str印tosporangium roseum)，该酶在天然的天玫瑰链霉菌中是一种胞内酶，需要用细胞破碎的方法才能检查到；而且在天然菌中该酶的含量也非常低，很难检验到海藻糖合成酶的活力。应用基因工程菌来表达本发明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高数千倍，可以用于海藻糖的生产。编码本发明所述的海藻糖合成酶的基因(trerS)是一段未确定功能的DNA片段， 长度为1701个碱基对，编码567个氨基酸，GC含量为65. 14%。本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势1.同样具有转化麦芽糖生成海藻糖的功能，但具有较小的分子量只有567个氨基酸，与日本林原研究所专利报道的来自Pimerlobacter sp. R48的海藻糖合成酶的625个氨基酸相比，本发明的海藻糖合成酶的氨基酸个数少了 58个，比同样是林原研究所报道的来自水栖嗜热菌iThermus aquaticus的海藻糖合酶的964少了 397个氨基酸，，与中国专利 ZL204410013007. 3报道的Thermobifida fusca海藻糖合成酶的611个氨基酸相比少了 44 个氨基酸，小分子的蛋白质酶更加容易地通过基因重组与表达技术来进行工业化生产重组酶，因而更有市场竞争力。2.转化麦芽糖生成海藻糖时能产生较高的海藻糖及产生较少的葡萄糖，目前报道的海藻合成酶基因在转化麦芽糖，随着反应温度的提高，会产生较多葡萄糖副产物，大多会产生10 30%的葡萄糖，反应产物中海藻糖糖的含量一般在50 65%，本发明的海藻糖合成酶与已经报道的海藻糖合成酶相比具有较低葡萄糖副产物，反应速度快，在30°C的反应温度时，反应1. 5个小时海藻糖含量可以达到80%，而葡萄糖含量约为5. 6%，这就有利于提干底物的转化效率，降低生产成本，从而更具有市场竞争力。3.外本发明的海藻糖具有适中最适反应温度30°C，在25 35°C也能保持80%的活力，最适的反应温度接近大多数季节的室温，这样可以避免较剧烈的温度调节，减少生产中温度调节的耗能，降低生产成本。4.本发明的海藻糖具有范围较广的最适反应温度和pH，在25 35°C和pH在 6. 5 7. 5都能保持较高的酶活力，这样可以使海藻糖的生产工艺更容易控制，提高生产工艺的稳定性。
图1是pH对酶活力的影响曲线图。图2是温度对酶活力的影响曲线图。图3是金属离子对酶活力的影响曲线图。图4是反应1. 的HPLC分析结果图。图5为不同时间对产物中各种糖含量的影响曲线图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，下述实施例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容，有些对本领域专业人员来说十显而易见的扩展内容虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。1、玫瑰链霉菌的培养玫瑰链霉菌(Sti^ptosporangium roseum)菌株编号为4. 1208，从中国微生物保藏中心购买，接种于以下培养基(克/升)葡萄糖4. O克，酵母提取物10克，麦芽提取物 10克L，用KOH调pH至7. 2，然后在25 30°C，180rpm/分钟的恒温摇床上振荡培养48小时，收集菌体用于总DNA的提取。2、玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因(treQ的克隆、表达及粗酶的制备根据Genbank中公布的Sti^ptosporangium roseum基因序列中注释为可能为海藻糖合成酶基因的序列，命名为Sro，设计相应引物扩增该基因并连接到表达载体上然后导入大肠杆菌进行表达，设计引物如下上游引物(Senseprimer) 5' -CTGAATTC ATGAGTCAGCTACCTGAG-3‘下游引物(AntisensePrimer) 5' -TCAAGCTT TTACGCCTCCTGGGTTAC-3‘上下游引物的5'端分别设计了的EcoR 1和Hind III酶切位点用于连接到表达载体PSE380上，用设计好的引物扩增可能为海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Sro，扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用EcoR 1和Hind III进行双酶切，与同样利用EcoR 1和Hind III进行双酶切的表达载体pSE380进行连接，然后经过筛选验证得到 Sro基因的表达重组质粒pSE380-Sro。把重组的表达质粒pSE380_Sro转化到大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞中，调取转化子于LB液体培养基中，在37°C摇床中培养，当0D600达到0. 8左右时，加入IPTG使其终浓度达到0. 5mmol/L，继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于转化麦芽糖的试验。3、玫瑰链霉菌海藻糖合成酶转化麦芽糖产物的分析利用高效液相色谱仪(HPLC)来进行海藻糖合成酶转化麦芽糖后的产物分析，分析条件，色谱柱Alltima Amino IOOA 5u 柱(4. 6mmX250mm)；检测器Alltech 2000ES 型蒸发光散射检测器；流动相70%乙腈/30% H2O ；流速lmL/min，柱温;35°C。(1)最适反应pH值的分析分别取96 μ L分别用pH为5. 5,6.0,6. 5,7.0,7. 5和8. O的磷酸盐缓冲液配制10% 的麦芽糖底物加4 μ L的酶液(35ug)，分别在30°C反应1小时，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图1。结果表明海藻糖酶的活力在PH6 8都能维持较高的活力，其中在pH7. 0 时活力最高。(2)最适反应温度测定取96 μ L 117.0的10%麦芽糖底物+4“1^酶液 C35ug)，在 10°C、15°C、20°C、25°C、 30°C、35°C、40°C和45°C不同的反应温下保温反应1小时，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图2。结果表明反应温度在20 40°C反应产物中的海藻糖含量在70%以上，在 30°C的反应温度时反应产物中的海藻糖含量最高可达80%。(3)金属离子对酶活的影响取96 μ L 117.0的10%麦芽糖底物+酶液4 4 1^(35呢)+1(^1^金属离子，使金属离子终浓度为5mmol/L，在25°C下反应1小时，按底物的消耗量来反映酶活的变化，以加磷酸盐缓冲液的酶活力为100%，结果见图3。结果表明!^3+和K1+对酶活影响不大，而Ca2+、 Mn2+和Fe2+对酶活有轻微的抑制作用，Cu2+、Ba2+和Zn2+对酶活有较强的抑制作用，其中Zn2+ 对酶活的抑制最强烈。(4)不同反应时间，产物中各种糖含量变化取96 μ L pH7. 0的10%麦芽糖底物+4ul酶液(35ug)，在pH7. 0和30°C的条件下反应不同的时间，然后测定反应中各种糖的含量，结果表明反应1. 5小时后海藻糖含量最大达到82%，葡萄糖5. 6%，麦芽糖12. 4%,HPLC分析见图4。随着反应时间的增加海藻糖和麦芽糖的含量都会减少，而葡萄糖的含量会增加，反应产物各种糖含量随着时间的变化结果见图5。4、从麦芽糖浆制造海藻糖取市售以淀粉制备麦芽糖含量为70 %的麦芽糖浆，用5mM，pH为7. 0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液配制成含30%麦芽糖的反应底物，取100升配制好的反应底物放置于不锈钢反应罐中，取上述第2步方法制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，加入到100升含30%麦芽糖的反应底物中，然后在30°C条件下反应M小时，然后用HPLC测定反应产物进行的海藻糖含量。反应M小时后HPLC分析反应产物的海藻糖含量为20. 9%，这表明在110升的总反应体积中共形成了约110升X20. 9%= 22. 99千克的海藻糖，麦芽糖的转化率为22. 99 千克/30千克=76. 63%，也就是说100升含30千克麦芽糖的麦芽糖浆经过酶的转化可以制备23. 43千克的海藻糖，海藻糖得率为76. 63%。5.从淀粉制备海藻糖将市场销售干物质含量为80 %的商品淀粉40kg用5mmol/L的pH为7. 0磷酸盐缓冲液调成100升的淀粉乳，加入耐高温α -淀粉保持温度90°C，液化至达到碘色后，再保温0. 5 1小时至DE值为10 12%，在110°C保温15分钟灭活淀粉酶活力，然后立即冷却至50°C后加入适量的β -淀粉酶和普鲁兰酶，在50°C保温M个小时后测定糖化产物的麦芽糖含量不再增加时，立即冷却至30°C加入制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，在30°C保温M个小时后测定用HPLC测定反应产物中的海藻糖含量。反应M小时后HPLC分析反应产物的海藻糖含量为19. 4%，结果表明海藻糖的产量110升X 19. 4 = 21. 34千克，从淀粉制备海藻糖的得率为21. 34千克/40千克= 53. 35%，也就是40千克干物质含量为80%的商品淀粉经过酶解可以制备21. 34千克的海藻糖，淀粉制备海藻糖得率为53. 35%，按干物质计算得率为66. 69%。
权利要求
1.一种玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利要求1的基因所编码的海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.权利要求2所述的海藻糖合成酶在从麦芽糖制备海藻糖中的应用，其特征在于，1) 将海藻糖合成酶基因构建基因工程菌进行藻糖合成酶的高效表达；2)收集制备重组海藻糖合成酶；3)以麦芽糖或者淀粉制备的麦芽糖浆为原料用海藻糖合成酶制备海藻糖。
全文摘要
一种玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，该基因克隆自玫瑰链霉菌(Streptosporangiumroseum)它表达的海藻糖合成酶能将麦芽糖转化为海藻糖，该基因的最大特点具有范围较广的反应温度和pH，在25~35℃和pH在6.5~7.5都能保持较高的酶活力，且转化效率高，反应速度快，在最佳的反应条件下转化麦芽糖生成海藻糖的反应产物中海藻糖含量可以达到82％，并且只产生很少的葡萄糖，有利于提高底物的转化率，降低生产成本。应用该基因生产的重组海藻糖合成酶可以以市场销售的麦芽糖浆或者以淀粉制备的麦芽糖浆为原料来制备海藻糖，这种海藻糖可应用于食品工业、美容化妆品、医药生物制品等领域。
文档编号C12R1/465GK102533822SQ20121001145
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者杜丽琴, 梁甲元, 韦宇拓, 黄日波 申请人:南宁中诺生物工程有限责任公司