一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂，生物菌体为玫瑰黄链霉菌变种0116，所述的活菌数≥10亿个/克。活菌包括链霉菌孢子和菌丝。制备方法是：将PDA上培养4-5天的链霉菌转接于种子培养基，3天后，将种子培养基转接于小试发酵培养基中进行液体发酵；3天后，转接于中试发酵培养基中扩大液体发酵；6天后，将发酵液按1∶4（固∶液）比例转接于粉碎后的玉米芯中，恒温培养室内发酵7-10天，烘干或者自然晾干，既得该玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂。其制备工艺简单，成本低，易保存，易生产。本发明具有防治棉花黄萎病等土传病害，促进农作物生长和提高产量的功能。
【专利说明】一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以玉米芯为基质的，可防治棉花黄萎病等重要农作物病害的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂。
【背景技术】
[0002]目前，农作物病害的防治主要以化学农药为主，其长期使用造成对病原菌的选择压力大，易产生抗药性。而且化学农药的高残留、高污染对环境和人、畜的安全造成严重的影响。因此低毒、低残留的生物农药已成为农药研制和生产需求的一大趋势。本发明专利涉及一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂，该菌株已委托“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行保藏，保藏单位地址:北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，菌株名称:玫瑰黄链霉菌0116，保藏编号=CGMCC N0.1471，保藏日期:2005年9月30日。玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的诱变菌株0116菌株(以下简称菌株0116),是一株经玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)诱变得到的菌株，其活菌和发酵液对多种重要植物病原菌有很强的抑制作用，例如棉花黄萎病病原菌、黄瓜白粉病病原菌、马铃薯疮痂病病原菌、番茄灰霉病病原菌、小麦根腐病病原菌等。温室及大田试验表明，0116菌株及其发酵液对棉花黄萎病有较好的防治效果。近年来，河北农业大学的河北省农作物病虫害生防工程技术研究中心又将该菌株及其发酵液应用到草莓重茬病、设施蔬菜(番茄、西葫芦等)重茬病等的防治上，均表现出良好的防治效果。河北农业大学生防中心于2011年申请了一个该菌株生防制剂的专利，即“一种玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂”，专利申请号:201110375945.8，其组份及含量为:玫瑰黄链霉菌菌株繁殖体^ 18个；润湿分散剂4%。所述的玫瑰黄链霉菌菌株繁殖体为菌株0116的菌丝和孢子。所述的载体为硅藻土。所述润湿分散剂为木质素磺酸钠。该专利存在的缺陷是硅藻土的吸附力很强，发酵过程中每翻一次盘都比较困难，且干燥完成后，出现大块的板结，较难粉碎，且粉碎过程中，容易对活菌菌体本身造成损害，影响制剂的防治效果。所以有必要在此基础上对制剂加以改进，寻找一种更简单、易规模化生产的制剂剂型。
【发明内容】
[0003]I本发明提供一种生产成本低、工艺简单、能够进行规模化生产、施药方式简便，包装和运输成本较小的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂。
[0004]2本发明是以如下技术方案实现的:
步骤一，取纯化后的玫瑰黄链霉菌0116，将0116菌株接种于PDA培养基上，28 °C培养4-5天后，以1%的比例接种到种子培养基中，放在摇床上，28°C /200r，继续培养3天，得到种子菌发酵液；
步骤二，将得到的种子菌发酵在无菌条件下，以1%的比例接种到50L的小试发酵罐培养基中，进一步进行小试发酵。得到足量的种子菌发酵液； 50L发酵罐培养所用的参数:培养温度:28°C 罐压:0.5Kg/cm2 转速:200r/m 培养时间:3天
步骤三，将得到的足量的种子菌发酵在无菌条件下，以1%的比例接种到500L的液体发酵罐培养基中，进一步进行中试，扩大发酵。得到玫瑰黄链霉菌0116液体发酵液；
500L发酵罐培养所用的参数:
培养温度:28°C 罐压:0.5Kg/cm2 转速:200r/m 培养时间:6天
所用的种子培养基为:3%花生饼粉，4.5%淀粉，1.5%葡萄糖，0.75%氯化钠，0.3%醇母膏，0.9%硫酸铵，0.03%磷酸二氢钾，0.375%碳酸钙，0.105%硫酸亚铁，0.105%硫酸锌，3%鹿糖,0.3%果糖，pH自然。
[0005]发酵罐培养基为四号发酵培养基:2 %花生饼粉，3%淀粉，I %葡萄糖，0.5 %氯化钠，0.2%醇母膏，0.6%硫酸铵，0.02%磷酸二氢钾，0.25%碳酸钙，0.07%硫酸亚铁，0.07%硫酸锌，2%蔗糖，0.2%果糖，pH自然。
[0006]步骤四，将玉米芯用装有5号筛的粉碎机粉碎，然后收集粗颗粒再用10号筛继续粉碎，收集这些颗粒用以下步接种发酵。最后将未能过10号筛的颗粒弃掉； 步骤五，将粉碎后且过10号筛的玉米芯在121 °C灭菌锅内灭菌3个小时后与玫瑰黄链霉菌0116发酵液按照质量比为1:4的比例在无菌条件下进行均匀混合，并转移到恒温培养室内进一步进行固体发酵。28-30 ± I °C，培养5-7天，每24小时搅拌一次。培养完成后，取出，置于35± 1°C鼓风干燥箱或自然条件下干燥。干燥7-10天后即可得到该玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂，湿度< 4-6%。
[0007]3检测:玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂需进行下例项目的质量检测。
[0008](I)镜检:链霉菌活体孢子和菌丝体数多、整齐，无杂菌。
[0009](2)平板计数:每克颗粒剂中含有链霉菌活体孢子和菌丝体总数> 10-20亿。
[0010](3)水分测定:(4-6%。
[0011](4)细度:98%的颗粒≤10目筛。10筛目的孔径为1700微米(标准为300-1700微米)。
[0012]研究工作表明，玫瑰黄链霉菌菌株0116的活体对植物病原物的抑制作用十分明显，而且菌株对环境的抗逆能力较强，生长繁殖所需的营养条件较低。活菌制剂开发的关键在于活菌的储存周期要达到I至2年。
[0013]田间药效
研究了玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂对棉花黄萎病的大田防治效果。
[0014]I试验方法:
将制得的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂分别按照200kg/亩、10kg/亩、50kg/亩的用量进行撒施，并利用10亿活芽孢/g枯草芽孢可湿性粉剂(河北省农林科学院植物保护研究所研制)作为对照药剂，每个处理重复3次，并设置清水对照。
[0015]2调查及统计方法:
每小区整体取样，全株调查。分别在现蕾期、结铃盛期和棉花采摘期对各株的黄萎病病级进行调查。并计算病情指数，防效以及显著方差分析(SPSS)。分级标准为O级:植株无病；I级:少数成叶上产生个别病斑或表现嵌色状；3级:植株30%~50%成叶嵌色状；5级:植株50%~100%成叶嵌色状，或叶片凋落，但有
棉铃；7级:植株成叶脱落，无棉铃；9级:植株死亡。
[0016]
【权利要求】
1.一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂，其特征在于，生物菌体为玫瑰黄链霉菌变种0116，所述的活菌数为≥10亿个/克。
2.如权利要求书I所述的一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂，其特征在于，所述的链霉菌活体菌包括链霉菌的孢子和菌丝体。
3.一种玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，将玫瑰黄链霉菌0116菌株接种于PDA培养基上，28 °C培养4_5天后，以1%的比例接种到种子培养基中。
4.培养条件为:28°C/200r，培养3天。
5.步骤二，将步骤一中的种子液以1%比例接入到50L小试液体发酵罐培养基中，进一步发酵，培养条件为:28°C /200r，培养3天，得到足量的种子发酵液； 步骤三，将步骤二中的种子液以1%比例接入到500L中试发酵罐培养基中，进一步扩大中试发酵，培养条件为:28°C /200r，培养6天，得到玫瑰黄链霉菌发酵液； 步骤四，将玉米芯用装有5号筛的粉碎机粉碎，然后收集粗颗粒再用10号筛继续粉碎，收集这些颗粒用以下步接种发酵。
6.最后将未能过10号筛的颗粒弃掉； 步骤五，将玉米芯和玫瑰黄链霉菌发酵液按照质量比1: 4比例接种于粉碎灭菌后的玉米芯中，充分混匀后置于容积为120L的塑料桶中，在恒温培养室内进一步固体发酵5-7天，每24h搅拌一次；培养完成后，烘干或者自然条件干燥7-10天，湿度< 4-6%，即可得到该玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂。
7.根据权利要求书3所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂制备方法，其特征在于，步骤一、二的培养条件为28°C /200r，培养3天。
8.根据权利要求书3所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制备方法，其特征在于，步骤三的培养条件为28°C /200r,培养6天。
9.根据权利要求书3所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制备方法，其特征在于，步骤四的发酵时间为7-10天，每24h搅拌一次。
10.根据权利要求书3所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制备方法，其特征在于，步骤五中所述干燥是烘干或者在自然条件下通风干燥处干燥7-10天，湿度≤4-6%。
11.根据权利要求书3所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制备方法，其特征在于，所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的颗粒大小为98% < 10目筛。
12.根据权利要求书3所述的玫瑰黄链霉菌微生物杀菌剂颗粒剂的制备方法，其特征在于，步骤二、三中所述的发酵罐培养基为:2%花生饼粉，3%淀粉，I %葡萄糖，0.5%氯化钠，0.2%醇母膏，0.6%硫酸铵，0.02%磷酸二氢钾，0.25%碳酸钙，0.07%硫酸亚铁，0.07%硫酸锌，2%蔗糖，0.2%果糖，pH自然。
【文档编号】A01N63/00GK104041519SQ201310078132
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】李亚宁, 李爱霞, 赤国彤, 刘大群, 陈英化, 张汀 申请人:河北农业大学