一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用，是以冰城链霉菌BC-109-6为出发菌株，进行milD基因和nanLD基因的阻断，构建冰城链霉菌的基因阻断突变菌，用所述基因阻断突变菌发酵生产米尔贝霉素A3/A4。本发明提高了米尔贝霉素A3/A4的产量，阻断了影响米尔贝霉素A3/A4分离纯化的杂质的生物合成，降低了生产成本，提高了经济效益。
【专利说明】一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]米尔贝霉素属于十六元环大环内酯类抗生素，与阿维菌素具有相似的结构。米尔贝霉素最初由日本科学家从土壤放线菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus的发酵液中分离得到，比目前使用最广泛的生物农药阿维菌素杀螨活性略高，而对大鼠的毒性比阿维菌素低40倍。因此，米尔贝霉素被美国环保署认定为危险性小的杀虫剂，被荷兰批准成为“GN0”(作物生产中的天然产物)，属于生态友好型农药，适用于有机农业害虫综合防治，被认为是当今世界上最优良的杀螨剂。米尔贝霉素已在美国、日本等43个国家和地区登记，用于苹果、柑橘、草莓、茶叶等24种植物上对阿维菌素、有机磷农药产生抗性的螨、斑潜蝇、蚜虫、粉虱的防治。在米尔贝霉素系列药物中，米尔贝霉素A3/A4具有较强的杀虫活性。因此，目前米尔贝霉素产品的商业化大多围绕米尔贝霉素A3/A4而进行。除Milbemectin(米尔贝霉素A3和A4的混合物)被用于杀螨剂外，米尔贝霉素A3/A4的I亏化物Milbemycin oxime也已商品化用于兽药,可有效预防犬心丝虫症及驱除肠道内的寄生虫(蛔虫、钩虫和鞭虫)。
[0003]冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis是本实验室从土壤中分离得到的米尔贝霉素产生菌。与其它米尔贝霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus 和 Streptomyces griseochromogenes 一样，冰城链霉菌 Streptomycesbingchenggensis除了产生米尔贝霉素A3/A4外，还产生其它米尔贝霉素系列化合物及其它的次级代谢产物。通过对Streptomyces bingchenggensis进行选育，我们获得了一株米尔贝霉素 A3/A4 高产菌株 Streptomyces bingchenggensis BC-109-6 (Xiang-JingWang, Xiao-Chong Wang, Wen-Sheng Xiang.1mprovement of milbemycin-producingStreptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet—andchemically induced mutants[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009，25:1051-1056)。虽然 Streptomyces bingchenggensis BC-109-6 中米尔贝霉素A3/A4的产量有了明显的提高，但其还产生杂质化合物C5-0-甲基米尔贝霉素B2、B3、β I和β2以及南昌霉素。这些杂质化合物的生物合成一方面会降低米尔贝霉素Α3/Α4的产量，另一方面会严重影响米尔贝霉素Α3/Α4的分离纯化。目前，冰城链霉菌Streptomycesbingchenggensis的全基因组测序已经完成,米尔贝霉素和南昌霉素的生物合成机制也已被阐明(Xiang-Jing Wang, Y1-Jun Yan, Bo Zhang, et al.Genome sequence of themilbemycin-producing bacteriumStreptomyces bingchenggensis[J].Journal of Bacteriology, 2010, 192:4526-4527)。因此，通过基因工程手段改造冰城链霉菌以提高米尔贝霉素A3/A4的产量和阻断其它杂质的生物合成对于提高产值、降低生产成本具有重要的意义 。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌BCJ36，是以冰城链霉菌BC-109-6为出发菌株，进行miID基因和nanLD基因的阻断，构建冰城链霉菌的基因阻断突变菌。
[0005]所述冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis 是公开于 Xiang-JingWang,Xiao-Chong Wang, Wen-Sheng Xiang.1mprovement of milbemycin-producingStreptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet—andchemically induced mutants[J].World Journal of Microbiology andBiotechnology, 2009, 25:1051-1056 的冰城链霉菌 Streptomyces bingchenggensisBC-109-6ο
[0006]上述的milD基因是被敲除而阻断的，nanLD基因是被外源基因插入而阻断的，所述的外源基因优选的是硫链丝菌素抗性基因tsr。
[0007]冰城链霉菌已经进行了全基因组测序，基因组的登录号是CP002047，milD基因是GenBank数据库登录号为CP002047的第1159758位到第1160618位所示的序列，nanLD基因是GenBank数据库登录号为CP002047的第10006136位到第10009168位所示的序列，tsr基因是GenBank数据库登录号为AY667410.1的第7240位到第8516位所示的序列。
[0008]该冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis的基因阻断突变菌的米尔贝霉素A3/A4产量得到了提高，且杂质C5-0-甲基米尔贝霉素B2、B3、β?和β 2以及南昌霉素生物合成被阻断。
[0009]本发明还提供了一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌的制备方法，包括以下步骤:
[0010]I)构建milD基因敲除质粒，其含有milD基因同源重组左臂和milD基因同源重组
右臂；
[0011]2)将步骤I)所得的milD基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子；
[0012]3)将冰城链霉菌BC-109-6作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，得到冰城链霉菌的milD基因阻断突变菌BCJ13 ；
[0013]4)构建nanLD基因中断质粒，其含有nanLD基因同源重组左臂、标记基因和nanLD基因同源右臂；
[0014]5)将步骤4)所得的nanLD基因中断质粒转化宿主细胞，获得转化子；
[0015]6)将冰城链霉菌的milD基因阻断突变菌作为受体，与步骤5)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即冰城链霉菌的milD基因和nanLD基因阻断突变菌BCJ36。
[0016]上述步骤I)中的milD基因同源重组左臂片段的构建引物milD-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.1，引物 milD-L2 核苷酸序列如 SEQ ID N0.2。
[0017]上述步骤l)milD基因同源重组右臂片段的构建引物milD-Rl核苷酸序列如SEQID N0.3，引物milD-R2核苷酸序列如SEQ ID N0.4。
[0018]上述步骤4)中nanLD基因同源重组左臂片段的构建引物nan-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.5，引物 nan-L 核苷酸序列如 SEQ ID N0.6。
[0019]上述步骤4)中nanLD基因同源重组右臂片段的构建引物nan-Rl核苷酸序列如SEQ ID N0.7，引物 nan-R2 核苷酸序列如 SEQ ID N0.8。
[0020]本发明还提供了一种上述构建的基因阻断突变菌用于制备米尔贝霉素A3/A4。[0021]所述应用方法，步骤如下:包括培养产米尔贝霉素A3/A4的冰城链霉菌的基因工程菌，从培养物中分离米尔贝霉素A3/A4。
[0022]本发明的有益效果如下:
[0023]1.本发明通过同源重组交换来阻断冰城链霉菌中的milD基因和nanLD基因，考察了其功能并提高了米尔贝霉素A3/A4的产量。 [0024]2.阻断了影响米尔贝霉素A3/A4分离纯化的杂质的生物合成。
[0025]3.降低了生产成本，提高了经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是milD基因敲除质粒的构建示意图。
[0027]图2是nanLD基因中断质粒的构建示意图。
[0028]图3是冰城链霉菌基因阻断突变菌的构建策略示意图；
[0029]((a)milD基因阻断突变菌的构建；(b)milD基因阻断突变菌BCJ13的PCR验证，I:DNA Marker, 2:以冰城链霉菌BC-109-6基因组为模板的PCR结果，3:以milD基因阻断突变菌BCJ13基因组为模板的PCR结果；(c) milD基因和nanLD基因阻断突变菌的构建；(d) miID基因和nanLD基因阻断突变菌BCJ36的PCR验证，I:DNA Marker，2:以milD基因和nanLD基因阻断突变菌BCJ36基因组为模板的PCR结果，3:以冰城链霉菌BCJ13基因组为模板的PCR结果)。
[0030]图4是出发菌株冰城链霉菌BC-109-6和冰城链霉菌基因阻断突变菌的发酵液的HPLC分析图谱；
[0031]((a)冰城链霉菌BC-109-6 ;(b)milD基因阻断突变菌BCJ13 ;(c)milD基因和nanLD基因阻断突变菌BCJ36)。
【具体实施方式】
[0032]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0033]所使用的工具酶、DNA分子量标记、胶回收试剂盒、PUC19载体均购自大连宝生物公司，使用方法参考商品说明书。
[0034]大肠杆菌E coli DH5a、ET12567，购自上海鼎国生物技术有限责任公司。
[0035]引物由大连宝生物公司合成。
[0036]冰城链霉菌BC-109-6可从东北农业大学生物化工教研室取得。
[0037]质粒pKC1139为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，阿普拉霉素抗性对大肠杆菌和链霉菌均有选择作用，链霉菌复制子为温敏型，温度高于34°C不能进行自主复制(参考文献 Bierman M, Logan R, O ' Brien K, et al.Plasmid cloning vectors for theconjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp[J].Gene,1992， 116:43-49)。
[0038]实施例1:milD基因阻断突变菌的构建
[0039]方法:[0040]l、milD基因敲除质粒的构建
[0041]利用引物milD-LKS' -CCAAGCTTTTCTCCTCGGTCGCGGGTCT-3;，下划线为 HindIII位点)和 mi 1D-L2 (5' -GCTCTAGAGGTCATGGCACTCCGGTTGTT-3'，下划线为 XbaI 位点)从冰城链霉菌基因组上PCR扩增得到milD基因同源重组左臂片段。
[0042]PCR反应的总体系为25 μ L，以I μ L的冰城链霉菌基因组DNA为模板进行反应。反应条件为:98°C Imin ；98°C IOs ；60.6°C 15s ；72°C Imin0 PCR产物上样电泳后，回收长度为985bp的目的条带。回收目的片段经HindIII和XbaI酶切后，与经HindIII和XbaI酶切后的PUC19载体连接，经测序验证后命名为pBC1577。
[0043]利用引物milD-RKS'-GCTCTAGAGAGTGGGCGCAGATGAAC-3'，下划线为 XbaI 位点)和 mi 1D-R2 (5' -CGGAATTCACCGCCGAGAACCACTACA-3'，下划线为 EcoRI 位点)从冰城链霉菌基因组上PCR扩增得到milD基因同源重组右臂片段。
[0044]PCR反应的总体系为25 μ L，以I μ L的冰城链霉菌基因组DNA为模板进行反应。反应条件为:98°C Imin ；98°C IOs ；61°C 15s ；72°C lmin。PCR产物上样电泳后，回收长度为1117bp的目的条带。回收目的片段经XbaI和EcoRI酶切后，与经XbaI和EcoRI酶切后的PBC1577载体连接，经测序验证后命名为pBC1397。
[0045]将pBC1397用HindIII和EcoRI进行酶切，酶切产物上样电泳后，回收长度为
2.1kb的目的条带。将回收片段与经HindIII和EcoRI酶切的pKC1139进行连接，经测序验证后命名为PBC3784，即milD基因敲除质粒。milD基因敲除质粒的构建过程见图1。
[0046]2、milD基因阻断突变菌的构建
[0047]将pBC3784质粒转化大肠杆菌ET12567，在含有阿普拉霉素(50μg/mL)的LB平板(参考文献萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M]，第二版，北京:科学出版社，1992)上筛选转化子ET12567/pBC3784。将转化子ET12567/pBC3784接种于2mLLB液体培养基(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL,阿普拉霉素25 μ g/mL), 37°C振荡培养过夜。次日以1:100的接种量转接于新鲜的LB(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL，阿普拉霉素25 μ g/mL) 20mL,培养至0D600值0.2~0.4为佳。用50mL离心管离心去上清(Hitachi CR21G，转子 R20A2，10, 000r/min, 15min), 10mL 新鲜 LB 洗涤细胞两次，最后用0.1倍体积LB培养基(2mL)悬浮。刮取冰城链霉菌孢子制备浓度约为IO8个/mL的孢子悬液，离心后沉淀换用2X YT[2X YT培养基(g/L):胰蛋白胨16g，NaC15g，酵母提取物10g，pH7.0]培养基悬浮，取500 μ L于50°C水浴中热激lOmin。取500 μ L的ET12567/pBC3784加入至500 μ L热激后的孢子悬液中，混合并轻摇。离心去除大部分上清，悬浮残余液体涂布MS平板(参考文献Kieser T, Bibb M.Practical Streptomyces Genetics [Μ].Norwich: TheJohn Innes Foundation, 2000)，28°C倒置培养。16 ~20h 后在平板上铺 ImL 含有 0.5mg 的萘啶酮酸及50 μ g阿普拉霉素的水溶液，液体被吸收后，继续于28°C倒置培养。挑取结合子单菌落于新鲜的MS平板上富集培养，该平板含有(Img萘啶酮酸和50 μ g阿普拉霉素)/(mL培养基)。
[0048]3、milD基因阻断突变菌的筛选及验证
[0049]选取较快长出孢子的上述所得的结合子进行温度诱导筛选及传代收集孢子，制备孢子悬液，以每培养皿约100个孢子涂布于MS平板(参考文献Kieser T1Bibb M.PracticalStreptomyces Genetics [Μ].Norwich: The John Innes Foundation, 2000),该平板含有50 μ g阿普拉霉素/ (mL培养基)的阿普拉霉素，28°C培养48~72h，观察有小菌落长出后转至39°C进行温度诱导。约7~10天后发现39°C培养下已长出大量的孢子。由于质粒PBC3784含有pKC1139来源的温度敏感型复制子，在高于34°C不能独立复制，故在39°C生长的菌落应该是质粒进入菌体后通过与同源臂的交换整合入染色体的整合子。挑取整合子于无抗性的MS平板中28°C松弛培养，连续传代，促使其发生双交换。经连续传代培养后，挑取同一个单菌落分别在有抗性与无抗性的MS平板上培养，筛选在无抗性平板生长而在抗性平板上不生长的菌落即为发生双交换或回复突变的克隆。 [0050]挑取10株以上筛选出的菌株，提取其基因组DNA进行PCR验证。上下游引物分别为 miID-Vl (5 ' -ATGCCACCCTCGGGTCCCTC-3 ')和 milD_V2(5' -AAGGGCGGCTACGGCTACGA-3' )。PCR 反应条件为:98°C lmin ；98°C IOs ；58°C 15s ；72 °C 3min。
[0051]同源重组示意图如图3a所示。只有质粒整合到基因组上发生双交换后，以miID-Vl和mi 1D-V2为引物、突变菌基因组为模板PCR扩增，才能得到理论上miID基因已被敲除的大小为2.38kb的阳性条带。而以miID-Vl和milD_V2为引物、起始菌株BC-109-6基因组为模板PCR扩增，得到的是带有milD基因、大小为3.14kb的条带。
[0052]结果:
[0053]从10株无抗性菌株中筛选得到I个双交换突变株，命名为BCJ13，双交换发生几率较低。PCR产物的电泳结果见图3b，PCR结果与理论相符。因此，菌株BCJ13为milD基因阻断突变菌。
[0054]实施例2:milD基因和nanLD基因阻断突变菌的构建
[0055]1、nanLD基因中断质粒的构建
[0056]利用引物nan-Ll (5' -GCTCTAGATCGTTGCTGCGGGTCCAT-3'，下划线为 XbaI 位点)和 nan-L2 (5 ' -CCAAGCTTCTACCCACGCCATCAACA-3 '，下划线为 HindIII 位点)从冰城链霉菌基因组上PCR扩增得到nanLD基因同源重组左臂片段。PCR反应的总体系为25 μ L，以I μ L的冰城链霉菌基因组DNA为模板进行反应。反应条件为:98°C lmin ；98°C IOs ；58.5°C 15s ；72°C lmin。PCR产物上样电泳后，回收长度为844bp的目的条带。回收目的片段经HindIII和XbaI酶切后，与经HindIII和XbaI酶切后的pUC19载体连接，经测序验证后命名为pBCN-1。
[0057]利用引物nan-Rl (5' -CGGAATTCGGATCACGGCGAGCACCTG-3'，下划线为 EcoRI 位点)和 nan-R2 (5' -GCTCTAGACTGCCCGCCACCCTCACCTT-3'，下划线为 XbaI 位点)从冰城链霉菌基因组上PCR扩增得到nanLD基因同源重组右臂片段。PCR反应的总体系为25 μ L，以I μ L的冰城链霉菌基因组DNA为模板进行反应。反应条件为:98°C lmin ；98°C IOs ；60.6 °C 15s ；72°C lmin。PCR产物上样电泳后，回收长度为926bp的目的条带。回收目的片段经XbaI和EcoRI酶切后，与经XbaI和EcoRI酶切后的pBCN_l载体连接，经测序验证后命名为pBCN-2。
[0058]利用引物tsr I (5 ' -GCTCTAGAGGTCGCGGTCGGTGGTGA-3 '，下划线为 XbaI 位点)和 tsr2 (5 ' -GCTCTAGAGACGATGAAGCCGTGGAAC-3 '，下划线为 XbaI 位点)以质粒 pHZ358(参考文献 Sun Y, Zhou X, Liu J, et al.' Streptomyces nanchangensis' , a producerof the insecticidal polyether antibiotic nanchangmycin and the antiparasiticmacrolide meiIingmycin, contains multiple polyketide gene clusters [J]..Microbiology, 2002, 148:361 - 371)为模板PCR扩增得到硫链丝菌素抗性基因盒tsr。PCR反应的总体系为25 μ L，以I μ L的质粒ρΗΖ358为模板进行反应。反应条件为:98°C lmin ；98°C IOs ；57.TC 15s ；72°C 75s。PCR产物上样电泳后，回收长度为1.29kb的目的条带。回收目的片段经XbaI酶切后，与经XbaI酶切后的pBCN_2载体连接，经测序验证后命名为pBCN-3。 [0059]将pBCN-3进行HindIII/EcoRI酶切，酶切产物上样电泳后，回收长度为3.06kb的目的条带，将回收片段与经Hindlll/EcoRI酶切的pKC1139载体连接，经测序验证后命名为PBC8559，即nanLD基因中断质粒。nanLD基因中断质粒的构建过程见图2。
[0060]2、milD基因和nanLD基因阻断突变菌的构建
[0061]将pBC8559质粒转化大肠杆菌ET12567，在含有阿普拉霉素(50μg/mL)的LB平板(参考文献萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M]，第二版，北京:科学出版社，1992)上筛选转化子ET12567/pBC8559。将转化子ET12567/pBC8559接种于2mLLB液体培养基(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL,阿普拉霉素25 μ g/mL), 37°C振荡培养过夜。次日以1:100的接种量转接于新鲜的LB(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL,阿普拉霉素25 μ g/mL) 20mL,培养至0D600值0.2~0.4为佳。用50mL离心管离心去上清(Hitachi CR21G，转子 R20A2，10, 000r/min, 15min), IOmL 新鲜 LB 洗涤细胞两次，最后用0.1倍体积LB培养基(2mL)悬浮。刮取冰城链霉菌BCJ13孢子制备浓度约为IO8个/mL的孢子悬液，离心后沉淀换用2X YT[2X YT培养基(g/L):胰蛋白胨16g，NaC15g，酵母提取物10g，pH7.0]培养基悬浮，取500 μ L于50°C水浴中热激lOmin。取500 μ L的ΕΤ12567/PBC8559加入至500 μ L热激后的孢子悬液中，混合并轻摇。离心去除大部分上清，悬浮残余液体涂布 MS 平板(参考文献 Kieser T, Bibb M.Practical Streptomyces Genetics [Μ].Norwich:The John Innes Foundation, 2000), 28°C倒置培养。16 ~20h 后在平板上铺 ImL含有0.5mg的萘啶酮酸及50 μ g阿普拉霉素的水溶液，液体被吸收后，继续于28°C倒置培养。挑取结合子单菌落于新鲜的MS平板上富集培养，该平板含有(Img萘啶酮酸和50 μ g阿普拉霉素)/ (mL培养基)。
[0062]3、milD基因和nanLD基因阻断突变菌的筛选及验证
[0063]选取较快长出孢子的上述所得的结合子进行温度诱导筛选及传代收集孢子，制备孢子悬液，以每培养皿约100个孢子涂布于MS平板(参考文献Kieser T1Bibb M.PracticalStreptomyces Genetics [Μ].Norwich: The John Innes Foundation, 2000),该平板含有50 μ g阿普拉霉素/ (mL培养基)的阿普拉霉素和15 μ g硫链丝菌素/ CmL培养基)的硫链丝菌素，28°C培养48~72h，观察有小菌落长出后转至39°C进行温度诱导。约7~10天后发现39 V培养下已长出大量的孢子。由于质粒PBC8559含有pKCl 139来源的温度敏感型复制子，在高于34°C不能独立复制，故在39°C生长的菌落应该是质粒进入菌体后通过与同源臂的交换整合入染色体的整合子。挑取整合子于无阿普拉霉素抗性而有硫链丝菌素抗性的MS平板中28°C松弛培养，连续传代，促使其发生双交换。经连续传代培养后，挑取同一个单菌落分别在有硫链丝菌素抗性与有阿普拉霉素抗性的MS平板上培养，筛选在有硫链丝菌素抗性平板生长而在有阿普拉霉素抗性平板上不生长的菌落即为发生双交换或回复突变的克隆。[0064]挑取10株以上筛选出的菌株，提取其基因组DNA进行PCR验证。上下游引物分别为 nanD-Vl (5 ' -ACTCCGCGTCGAAGTCCCC-3 ')和 nanD_V2(5' -GCGGTTTTGCGATTCAGGTAT-3' )。PCR 反应条件为:98°C lmin ；98°C IOs ；59°C 15s ；72 °C 3min。
[0065]同源重组示意图如图3c所示。只有质粒整合到基因组上发生双交换后，以nanD-Vl和nanD_V2为引物、突变菌基因组为模板PCR扩增，才能得到理论上nanLD基因已被硫链丝菌素抗性基因盒tsr代替的大小为1.95kb的阳性条带。而以nanD-Vl和nanD_V2为引物、起始菌株BCJ13基因组为模板PCR扩增，得到的是带有nanLD基因、大小为3.39kb的条带。
[0066]结果:
[0067]从10株无抗性菌株中筛选得到4个双交换突变株，命名为BCJ36，双交换发生几率较低。PCR产物的电泳结果见图3d，PCR结果与理论相符。因此，菌株BCJ36为milD基因和nanLD基因阻断突变菌。
[0068]实施例3:起始菌株BC-109-6、基因阻断突变菌BCJ13和BCJ36的发酵分析
[0069]方法:[0070]挑取菌株于高氏一号斜面28°C培养,培养6天后,接种于种子培养基(鹿糖10.0,酵母提取物5.0，蛋白胨3.5，脱脂奶粉1.0，K2HPO4 0.5 (g/1000mL)，ρΗ7.0)，然后置于28°C，250r/min条件下培养42h。取2.0mL的种子培养液转接于25mL的发酵培养基(蔗糖80.0，黄豆饼粉 20.0，脱脂奶粉 1.0，CaCO3 3.0, K2HPO4 1.0, FeSO4.7Η20 0.1 (g/1000mL)，ρΗ7.2)中，28°C，250r/min培养8天。发酵液与等体积的甲醇混合浸泡12h，离心后取上清液做HPLC分析。HPLC条件，流动相A:乙腈:水:甲醇=350:50:100，流动相B:甲醇，梯度洗脱:15min内流动相B的浓度从O升至100%，流速:1.0mL/min，柱温:25°C，检测波长:242nm，进样量:10 μ L,分析柱:N0VA-PAKR C18 (3.9 X 150mm, 5 μ m, Waters, Milford, MA)。
[0071]结果:
[0072]milD基因阻断突变菌BCJ13、milD基因和nanLD基因阻断突变菌BCJ36、起始菌株冰城链霉菌BC-109-6的发酵液的HPLC分析结果如图4所示，可见:milD基因的敲除可中断C5-0-甲基米尔贝霉素B2、B3、β I和β 2的生物合成，且米尔贝霉素Α3/Α4的产量有显著的提高，单位产量达2237±54yg/mL，进一步阻断nanLD基因可中断南昌霉素的生物合成，且米尔贝霉素A3/A4的产量有进一步的提高，单位产量达2312±47μ g/mL，比起始菌株冰城链霉菌BC-109-6米尔贝霉素A3/A4的产量(1326±37 μ g/mL)提高了 74%。
【权利要求】
1.一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌，其特征在于，以冰城链霉菌BC-109-6为出发菌株，进行milD基因和nanLD基因的阻断，构建冰城链霉菌的基因阻断突变菌。
2.根据权利要求1所述基因阻断突变菌，其特征在于，所述的milD基因是被敲除而阻断的，nanLD基因是被外源基因插入而阻断的，所述的外源基因是硫链丝菌素基因tsr。
3.根据权利要求1所述基因阻断突变菌，其特征在于，对冰城链霉菌BC-109-6进行改造，包括以下步骤: 1)构建miID基因敲除质粒，其含有miID基因同源重组左臂和miID基因同源重组右臂； 2)将步骤I)所得的milD基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子； 3)将冰城链霉菌BC-109-6作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即冰城链霉菌的mi ID基因阻断突变菌； 4)构建nanLD基因中断质粒，其含有nanLD基因同源重组左臂、标记基因和nanLD基因同源右臂； 5)将步骤4)所得的nanLD基因中断质粒转化宿主细胞，获得转化子； 6)将冰城链霉菌的milD基因阻断突变菌作为受体，与步骤5)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，得到冰城链霉菌的milD基因和nanLD基因阻断突变菌。
4.根据权利要求1所述基因阻断突变菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)构建miID基因敲除质粒，其含有miID基因同源重组左臂和miID基因同源重组右臂； 2)将步骤I)所得的milD基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子； 3)将冰城链霉菌BC-109-6作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即冰城链霉菌的mi ID基因阻断突变菌； 4)构建nanLD基因中断质粒，其含有nanLD基因同源重组左臂、标记基因和nanLD基因同源右臂； 5)将步骤4)所得的nanLD基因中断质粒转化宿主细胞，获得转化子； 6)将冰城链霉菌的milD基因阻断突变菌作为受体，与步骤5)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，得到冰城链霉菌的milD基因和nanLD基因阻断突变菌。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤I)中的milD基因同源重组左臂片段的构建引物milD-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.1，引物milD_L2核苷酸序列如SEQ IDN0.2。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤l)milD基因同源重组右臂片段的构建引物miID-Rl核苷酸序列如SEQ ID N0.3，引物milD_R2核苷酸序列如SEQ ID N0.4。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤4)中nanLD基因同源重组左臂片段的构建引物nan-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.5，引物nan_L核苷酸序列如SEQ ID N0.6。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤4)中nanLD基因同源重组右臂片段的构建引物nan-Rl核苷酸序列如SEQ ID N0.7，引物nan_R2核苷酸序列如SEQ ID N0.8。
9.一种发酵生产米尔贝霉素A3/A4的方法，其特征在于，以权利要求1所述冰城链霉菌的基因阻断突变菌发酵生产米尔贝霉素A3/A4。
10.一种发酵生产米尔贝霉素A3/A4的方法，其特征在于，具体步骤如下:1)构建miID基因敲除质粒，其含有miID基因同源重组左臂和miID基因同源重组右臂； 2)将步骤I)所得的milD基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子； 3)将冰城链霉菌BC-109-6作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即冰城链霉菌的mi ID基因阻断突变菌； 4)构建nanLD基因中断质粒，其含有nanLD基因同源重组左臂、标记基因和nanLD基因同源右臂； 5)将步骤4)所得的nanLD基因中断质粒转化宿主细胞，获得转化子； 6)将冰城链霉菌的milD基因阻断突变菌作为受体，与步骤5)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，得到冰城链霉菌的milD基因和nanLD基因阻断突变菌； 7)以冰城链霉菌的milD基因和nanLD基因阻断突变菌发酵生产米尔贝霉素A3/A4。
【文档编号】C12N1/21GK103468625SQ201310409240
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】向文胜, 张继, 王相晶, 安静 申请人:东北农业大学