糖基化的麦芽糖结合蛋白及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种糖基化的麦芽糖结合蛋白及其制备方法与应用，一种麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。此糖-蛋白缀合物疫苗作为TD抗原不仅能在健康成年人体内产生持久的免疫力，而且针对上述高危人群同样有效。
【专利说明】糖基化的麦芽糖结合蛋白及其制备方法与应用
【技术领域】:
[0001 ] 本发明涉及一种糖基化的麦芽糖结合蛋白的制备方法及其制备方法与应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein,简称:MBP)是大肠杆菌麦芽糖转运系统的成员之一，主要负责麦芽糖的捕获和转运。由于MBP融合表达重组蛋白具有表达水平高，易于纯化等优点，MBP常作为融合标签被广泛应用。过去人们普遍认为MBP标签没有生物活性或生物活性较低，其融合表达的蛋白可直接进行生物活性研究。但最近有研究发现，MBP作为载体蛋白，能提高亚单位疫苗对抗病原菌的作用。MBP可通过作用于TLR4介导的信号通路，促进细胞因子的分泌和树突状细胞的成熟，增强细胞免疫应答作用。
[0003]将细菌多糖如0-PS、CPS连接到具有免疫原性的载体蛋白中形成糖-蛋白缀合物，此糖蛋白能引发依赖于T细胞的免疫应答，被认为是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有广阔应用前景。合成糖蛋白疫苗的方法主要有化学法和酶法。目前被广泛应用的是化学法，通过基因工程技术表达和纯化载体蛋白，然后同提纯的病原菌表面多糖进行化学耦联。由于糖链化学激活的随机性，交联产生的糖蛋白具有高度不均一性；同时，此方法存在着步骤繁杂、操作困难等问题。近几年兴起的酶法利用空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似性的特点，将空肠弯曲菌的一种寡糖基转移酶PglB构建到大肠杆菌中，通过这种改造后的PglB介导的大肠杆菌糖蛋白合成系统，可以体内一步法合成糖蛋白。酶法克服了化学法的不足，具有很大潜力，近几年其理论和方法也不断改进和兀吾。
[0004]MBP表面某些特定的位置氨基酸序列的变化，如突变，缺失，插入等不会影响其本身转运麦芽糖的活性。有研究证明，MBP`蛋白第178位和341位氨基酸残基插入7_13个氨基酸残基，不会影响该蛋白的活性。天然的MBP没有可被PglB识别的糖基化位点。因此建立一种方法使MBP可被PglB识别且有效糖基化成为合成糖蛋白的前提和关键。
【发明内容】
:
[0005]本发明的目的在于建立一种有效的麦芽糖结合蛋白糖基化方法，同时将麦芽糖结合蛋白引入糖蛋白疫苗中，解决了现有技术中的空白和不足，也拓展了糖蛋白疫苗的范围。
[0006]一种麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]一种麦芽糖结合蛋白，它是由SEQ ID N0.3所示氨基酸序列在178位和341位分别结合来自大肠杆菌0157:H7的脂多糖O-PS组成。
[0008]上述麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut的制备方法,包括如下步骤:
[0009](I)设计一对嵌合引物，其序列分别为:
[0010]malE-178-l:5’ TGTTGCGTTCTGGTC, malE-178-2:5’ GACCAGAACGCAACA ；
[0011]设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为:[0012]k-waaL-F: CTCGAGAAAAAAAACTGGATAGCGTACTGGAACAGAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和[0013]k-waaL-R: TTACTTGTTTTTCATCGCTAATAATAAGCCGGCGTAAACATGGGAATTAGCCATGGTCC
[0014]然后以malE-178-1和k-waaL-F为引物，以malE基因为模板，合成PCR片段 k_waaL_F_malE_178_l ;然后以 malE_178_2 和 k_waaL_R 为 _旲板，合成片段malE-178-2-k-waaL-R ；
[0015]以PCR 片段 k-waaL-F-malE-178-l 和 malE-178-2-k-waaL-R 混合物作共同模板，以malE基因为模板，合成PCR产物，制得在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因;
[0016](2)设计一对嵌合引物，其序列分别为:
[0017]malE-341-1:TGTTGCGTTCTGGTCACGCGGATCTTTCACCAACTC 和
[0018]malE-341-2:GACCAGAACGCAACAATTGCCGCCACTATGGAAAAC
[0019]设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为:
[0020]t-waaL-F:GTATGTCTCTTGCAGATTTG 和
[0021]t-waaL-R:ATGGCGTAACTCAAAGATTC
[0022]然后以malE-341-l和t_waaL_F为引物，以步骤(1)制得的在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因为模板，合成PCR片段t-waaL-F-malE-341-l ;然后以malE_341_2 和 t_waaL_R 为|旲板，合成片段 malE_341_2_t_waaL_R ；
[0023]以PCR 片段 t-waaL-F-malE-341-l 和 malE-341-2-t-waaL-R 混合物作共同模板，以步骤(1)制得的在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因为模板，合成PCR产物，制得在N178位和N341位都插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因。
[0024]上述麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut在制备麦芽糖结合蛋白中的应用。
[0025]上述应用，步骤如下:
[0026]本发明所述关于糖蛋白疫苗的制备，包括I)用MBP替代PglB的天然底物蛋白AcrA，拓展了蛋白的种类；
[0027]2)将表达MBP的malE基因和表达PglB的PglB基因同时构建到一个质粒载体PBAD24中，大大简化了步骤，同时为其利用提供了便利。
[0028]其中:
[0029]I)所述表达大肠杆菌MBP蛋白的malE基因来自质粒pMAL_p5X，基因大小为1176bp。
[0030]2)所述pBAD24-pglB-malE的构建方法:在pglB基因两侧设计酶切位点NcoI和SmaI (Nco1-pglB-Smal);在malE基因前设计SD序列，并在两侧设计酶切位点SmaI和SalI(Smal-SD-malE-Sall)。通过酶切连接将上述两序列插入到质粒pMAL_p5X中。
[0031]有益效果
[0032]此糖-蛋白缀合物疫苗作为TD抗原不仅能在健康成年人体内产生持久的免疫力，而且针对上述高危人群(例如婴幼儿)同样有效。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1:N-连接糖基化途径同脂多糖合成途径的相似性比较(A、B)以及大肠杆菌PglB介导的糖蛋白合成系统的构建(C)。
[0034]图2:malE基因糖基化序列插入丨呆作不意图。
[0035]其中:虚线所指示的序列即为插入糖基化序列。
[0036]图3:表达质粒 ρΜ(ρΒΑ024-πι&1Ε_)、ρΡ(ρΒΑ024-ρ8?Β)、ρΡΜ(ρΒΑ024-ρ8?Β-π^1Ε_)的构建。
[0037]图4:waaL基因敲除相关PCR检测琼脂糖凝I父电泳图。
[0038]其中:M:lkbDNA ladder ;1:waaL 基因(E.coli 086:Κ61:Β7) ;2 和 5:kana 抗性敲除基因(E.coli 086:K61:B7/AwaaL::FRT-kana-FRT) ;3 和 4:FRT 位点基因(E.coli086:K61:B7/AwaaL::FRT);所用引物为检测引物 t-waaL-F 和 t-waaL-R?
[0039]图5:ffestern bolt分析检测MBP蛋白糖基化。
[0040]其中:1 =MBP-Mut蛋白(含pM);2:pglB蛋白(含pP);3:糖基化的MBP-Mut蛋白(含pPM);以上 3 种蛋白均在 E.coli 086:K61:B7/AwaaL::FRT 中表达。
【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
[0042]实验材料
[0043]本实施例所用菌株、质粒及引物表1所示。
[0044]表1本实施例所用载体/质粒/引物
[0045]
【权利要求】
1.一种麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种麦芽糖结合蛋白，它是由SEQ ID N0.3所示氨基酸序列在178位和341位分别结合来自大肠杆菌0157: H7的脂多糖O-PS组成。
3.权利要求1所述麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)设计一对嵌合引物，其序列分别为:
malE-178-l:5’ TGTTGCGTTCTGGTC，malE-178-2:5’ GACCAGAACGCAACA ； 设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为:k-waaL-F: CTCGAGAAAAAAAACTGGATAGCGTACTGGAACAGAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和k-waaL-R:TTACTTGTTTTTCATCGCTAATAATAAGCCGGCGTAAACATGGGAATTAGCCATGGTCC然后以malE-178-l和k-waaL-F为引物，以malE基因为模板，合成PCR片段 k_waaL_F_malE_178_l ;然后以 malE_178_2 和 k_waaL_R 为 +旲板，合成片段malE-178-2-k-waaL-R ； 以 PCR 片段 k-waaL-F-malE-178-l 和 malE-178-2-k_waaL-R 混合物作共同模板，以malE基因为模板，合成PCR产物，制得在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因； (2)设计一对嵌合引物，其序列分别为:`
malE-341-1:TGTTGCGTTCTGGTCACGCGGATCTTTCACCAACTC 和
malE-341-2:GACCAGAACGCAACAATTGCCGCCACTATGGAAAAC
设计一对模板基因的最远端上下游引物，分别为:
t-waaL-F:GTATGTCTCTTGCAGATTTG 和 t-waaL-R:ATGGCGTAACTCAAAGATTC
然后以malE-341-1和t_waaL_F为引物，以步骤(1)制得的在NI78位插入五肽糖
基化序列位点的malE突变基因为模板，合成PCR片段t-waaL-F-malE-341-l ;然后以
malE_341_2 和 t_waaL_R 为|旲板，合成片段 malE_341_2_t_waaL_R ； 以PCR片段t-waaL-F-malE-341-l和malE-341-2-t_waaL-R混合物作共同模板，以步骤(I)制得的在N178位插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因为模板，合成PCR产物，制得在N178位和N341位都插入五肽糖基化序列位点的malE突变基因。
4.权利要求1所述麦芽糖结合蛋白表达基因malE-Mut在制备麦芽糖结合蛋白中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103509807SQ201310409028
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】陈敏, 杨公进, 马中瑞 申请人:山东大学