专利名称：胆汁三烯结合蛋白(bbp)的序列优化和高效表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白分子的制备方法，具体的说，本发明涉及一种具有高效表达 活性的胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的制备方法。
背景技术：
某些有毒有害小分子化合物如农药、兽药的残留等，是产生食品安全问题的主要 因素，如何制备特异识别的小分子化合物的配体已经成为研究关注的热点问题。研究发 现，胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子(bilin binding protein, BBP)对小分子具有较强的结 合能力，具有重要的生物学功能，可用于运输和储藏次级代谢产物。BBP是以小分子受体 蛋白-脂质运载蛋白(lipocalin)为骨架的蛋白，蛋白质折叠成β桶状，提供了一个疏水 的口袋结构，以便结合和运输疏水性小分子。与抗体相比，BBP结合小分子有独特的优点 BBP分子骨架构象更适合与小分子物质结合，而抗体是免疫系统针对大分子物质应激产生 的蛋白，其构象上更适合与大分子物质结合；BBP片段比抗体小，通过基因工程更容易对其 进行操作，无需免疫动物、细胞融合等复杂制备过程；BBP 口袋型识别位点具有很大的分子 接触表面，结构稳定，避免了免疫球蛋白轻重链的非共价键结合。Gchlehuber S, Skerra A. Tuning ligandaffinity, specificity, and folding stability of an engineered lipocalin variant-a so-called'anticalin'-using a molecular random approach[J]. biophys chem, 2002,96 (2-3) :213-228) Beste 等以 BBP 为骨架基础，结合噬菌体表面 展示技术，构建了随机突变肽库，筛选到3个对荧光素有特异吸附的突变体，亲和力高达 35. 2nmol/L，且交叉反应率低。BBP最初是从大菜粉蝶(Pieris brassicae)中得到的，其提 取困难，成本高，提取效率低。因此，利用基因工程方法高效表达BBP分子，对筛选小分子模 拟抗体的研究具有重要的意义。
发明内容
为克服上述野生型BBP制备的缺点，降低其制备成本并有效保持其活性，本发明 提供了一种制备并纯化胆汁三烯结合蛋白(BBP)的方法及其多克隆抗体的制备方法。本发 明的新型胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子，是优化后的野生型的BBP分子，其序列与原序列相 比，57个碱基被替换，序列中所有的大肠杆菌低频密码子均被高频密码子所替换。与野生 型BBP相比，优化后的胆汁三烯结合蛋白(BBP)基因更适合在大肠杆菌中实现功能表达；本 发明公开了一种具有序列表中序列1所示新型胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子本发明还公开 了一种编码新型胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的基因，该基因具有序列表中序列2所示的 核苷酸序列。本发明还公开了上述胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的制备方法。该方法包括 如下步骤(1)对野生型BBP序列的优化设计与引物合成；(2) PCR合成优化后BBP序列并与表达载体连接构建pBV220_BBP表达载体；(3)纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京科学出版社，2000，51-54.)。；(4)胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的分离纯化；制备胆汁三烯结合蛋白编码基因可以按照实验室常规方法进行，优选PCR法。优 选PCR重叠引物延伸法(黄培堂等译，J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，分子克隆实验指南第 三版，pl091-1113)。所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业pET系列载体 和国内广泛使用的PBV220载体，优选pBV220载体。大肠杆菌可以是适合原核系统表达的 配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选E. coli BL21 (DE3)系列；当使用pBV220载 体时宿主菌可选择多种商业上提供的大肠杆菌，优选E. coli DH5ci。本发明根据大肠杆菌 偏好密码子设计并合成BBP序列的引物，PCR扩增优化后的BBP序列克隆至载体pEasy-T3 上，构建克隆载体pEasy-BBP。测序后，将该序列克隆至表达载体pBV_220并转化至DH5 α。 在热激诱导下，在大肠杆菌DH5 α中实现了高效表达，经分离纯化，获得了电泳纯的胆汁三 烯结合蛋白(BBP)分子。纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白质技术 手册[Μ].北京科学出版社，2000，51-54.)。经热激诱导后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE 电泳。电泳检测结果(图6)显示携带重组质粒pBV-220BBP的表达菌株在分子量21KD的位 置上产生一条特异蛋白条带，与BBP蛋白分子量相符，而对照菌株中无此相应蛋白条带。凝 胶分析表明，PBV-220BBP表达量约占细菌总蛋白的60%以上。本研究首次成功合成了优化 后的BBP的序列，且我们所构建的表达载体pBV-220BBP表达量高，经纯化后纯度可达95% 以上。
图1为BBP序列的优化前后比较图2为1. 5%凝胶电泳后回收纯化PCR产物图3为1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测优化后bbp序列的PCR产物图4为PCR扩增后阳性克隆图5为bbp基因成功连接T载体图6为转化子菌落扩增产物图7为BamH I与EcoR I酶切表达载体pBV_220BBP扩增产物 图8为重组质粒pBV-220BBP的表达菌株的表达产物 图9为BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后BBP蛋白浓度 图10为SDS-PAGE鉴定复性、纯化后的BBP蛋白
具体实施例方式实施例一胆汁三烯结合蛋白突变基因构建、表达质粒的鉴定及表达。1.材料与方法1.1 材料1.1.1质粒与菌株克隆载体pEasy-T3购自北京全式金公司；表达载体pBV_220、大肠杆菌E. coli DH5a由本实验保存。1.1. 2酶及主要试剂胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、BamH I.EcoR I及T4DNA Ligase均购自!Iomega 公司；Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、DL2000核酸分子量标准购自北京TIANGEN公司，低分子量蛋白标准物购自TaKaRa公司。1.2 方法1. 2. IBBP序列的优化设计与引物合成根据大肠杆菌偏爱密码子，利用Condonopt密码子优化软件优化从GenBank中检 索到的BBP基因序列，全部选用大肠杆菌偏好密码子，设计合成BBP序列的引物1-12 (表 1)。为了便于蛋白表达，引物FPBV和RPBV引入了 EcoR I和BamH I的酶切位点，同时在3， 末端引入6XHis标签以利于进一步纯化。表1.互为重叠的寡聚核苷酸引物
权利要求
1.一种胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子，其特征在于优化后的BBP序列与原序列相比，57 个碱基被替换，序列中所有的大肠杆菌低频密码子均被高频密码子所替换。
2.根据权利要求1的胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子，其特征在于具有序列表中序列1 所示的碱基序列。
3.编码权利要求1的胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的基因，其特征在于具有序列表中 序列2所示的核苷酸序列。
4.权利要求1或2所述的胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的制备方法，其特征在于包括 如下步骤(1)对野生型BBP序列的优化设计与引物合成；(2)PCR合成优化后BBP序列并与表达载体pBV-220连接，构建pBV_220BBP表达载体；(3)在大肠杆菌DH5ci中进行高效表达；(4)胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子的分离纯化；
5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于步骤( 所述表达载体是PBV220。
6.根据权利要求4的制备方法，其特征在于步骤C3)所述大肠杆菌是E.coli DH5ci。
全文摘要
本发明公开了一种胆汁三烯结合蛋白(BBP)分子。本发明根据大肠杆菌偏好密码子，以野生型胆汁三烯结合蛋白基因序列为模板，通过设计并合成优化BBP序列的引物，PCR扩增优化后的BBP序列与表达载体连接、在大肠杆菌中高效表达、纯化等步骤，获得了功能表达的BBP蛋白分子。
文档编号C12N15/70GK102040657SQ20091007095
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者孙思明, 宁保安, 王彩红, 王红勇, 高志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所