传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物疾病检测领域，尤其是一种以包含决定羊痒病抗性/敏感性的羊朊蛋 白编码基因PRNP的第136、 154和171位密码子为靶目标设计的生物制剂，借助实时荧 光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR)检测体系及其之后的终点读板 模式，对PRNP的第136、 154和171位密码子进行检测，用来判定被检测羊是否含有传 染性羊痒病抗性基因，即一种传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备方法和 应用。
背景技术：
羊痒病(scrapie)俗称"瘙痒病"，属于传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)的一种，是由羊痒病朊病毒引起成年绵羊和山羊 的一种慢性进行性的、致死性神经系统疾病(Stanley BPrusiner. The Prion Diseases. Scientific A鹏rican, 1995， 48-57)。瘙痒是痒病的一个显著特征，也是其名字的来 源。此外，共济失调、麻痹、衰弱、震颤、姿势不稳、痴呆、知觉过敏、行为异常等神 经症状也是其主要的临床症状，死亡率达100%。组织病理学病变局限于祌经系统，以神 经元空泡化，灰质海绵状病变，神经元丧失，神经胶质和星状细胞增生，病原因子PrPsc 蓄积和淀粉样蛋白斑块形成为特征，病变通常为两侧对称(Aguzzi A， H印pner FL. Pathogenesis of prion diseases: a progress report. Cell Death and Differentiation. 2000， 7:889-902; Combrisson H， Robasine G， BRUGERE， etal. Urody画ic parameters in scrapie-afected ewes and their modifications in the course of the disease. Neurourology and rodynamics. 1998, 17: 555-563)。
羊痒痒病迄今已有270多年的历史记载，是最早所知的传染性海绵状脑病，多发于 绵羊和山羊，目前在世界许多地方流行。本病最早于18世纪发生于英格兰，以后陆续传 入比利时、法国、德国、西班牙、南非、印度、冰岛、澳大利亚、新西兰、加拿大和美 国。病原主要定位于中枢神经系统、脾脏和淋巴结中。不同品种、性别的绵羊和山羊均 可发病，但以美国萨福克种羊的敏感性较高。该病通常发生于病羊污染牧地中放牧的羊 群。以2 4岁的羊多发。可通过直接接触和间接接触感染。感染母羊的胎盘组织中含有 病原，因此也可通过胎盘垂直传播。患病母羊和公羊的后代，其痒病的发病率较高。
本病除羊尸体消瘦和皮肤损伤外没有肉眼可见的病变，其诊断主要依靠临症状2见察
与病理组织学检查进行确诊。此外，本病还可通过病羊的肉骨粉等传染给牛，而^g牛感 染为疯牛病。人食用了被疯牛病病原污染的食品，可感染上传染性海绵状脑病——亲斤变 异型克雅氏病(即nvCJD)。因此，羊痒病的诊断是根除和控制疯牛病、克雅氏病的关键。 羊痒病等传染性海绵状脑病病原是一种无核酸的蛋白质侵染颗粒(即朊病毒)，是由宿主神经细胞表面正常的一种唾液酸糖蛋白(PrPc)在三级结构发生改变后形成的异 常蛋白(PrPsc)。现在认为是由于PrPsc侵入后，与正常的PrPc结合形成PrPsc-PrPc二 聚体，导致PrPc构型发生改变，转变为PrPsc-PrPsc，此二聚体解体后产生两个PrPsc， 周而复始，使PrPsc数量呈指数增加(Kazuhiko A, Noriyuki N， Suehiro S , etal. Biological and Biochemical Characteristics of Prion Strains Conserved in Persistently Infected Cell Cultures [J]. Journal of virology. 2005， 79: 7104-7122; Thierry B， Carole C, Anne-GaSlle B. Molecular Analysis of the Protease-Resistant Prion Protein in Scrapie and Bovine Spongiform Encephalopathy Transmitted to Ovine Transgenic and Wild-Type Mice [J]. Journal of Virology, 2004， 78: 6243-6251)。
到目前为止，科学家们利用上述这种特性在检测疯牛病和羊痒病等方面已开发出了 免疫组织化学方法、免疫转印方法、组织印记法、ELISA方法、western-blot方法等
(Stanley B Prusiner. Prion Diseases and the BSE crisis[J]. Science, 1997， 278(10):245-251; Somerville R, Hamilton S， Fernie K. Transmissible spongiform encephalopathy strain, PrP genotype and brain region all affect the degree of glycosylation of PrPSc[J]. The Journal of general virology, 2005， 86:241-246)。 但上述方法均为死后诊断和确诊法，不利于本病的控制和根除。
研究表明，羊痒病的发生与绵羊朊蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关，主要表 现在绵羊PRNP第136、 154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性相关
(Vaccaria G, Contea M L， Morellia G， etal. Primer extension assay for prion protein genotype determination in sheep. Mol Cell Probe, 2004, 18(1): 33-37; Westaway D, Zuliani V, Cooper CM, Da Costa M， Neuman S， Jenny AL， Detwiler L， Prusiner SB. Homozygosity for prion protein alleles encoding glutamine-171 renders sheep susceptible to natural scrapie. Genes Dev, 1994， 8 (8) : 959-969; TranulisMA. Influence of the prion protein gene, Prnp， on scrapie susceptibility in she印.Apmis, 2002， 110(1): 33-43)。在密码子136， 154和171分别编码不同的氨 基酸，用代表特定氨基酸的字母来表示，如一只绵羊的PRNP基因型表示为ARQ/AHQ,表示 密码子136上编码的两个氨基酸是丙氨酸，密码子154上编码的两个氨基酸分别是精氨酸 和组氨酸，密码子171上编码的两个氨基酸都是谷氨酰胺。患有TSE的病羊其基因组中的 三个等位基因发生了突变，即136位点上的A突变成了V、 154位点上的R基因突变成了H基 因，171位点上的Q基因突变成了R或H，研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基 因型，具有此基因型的羊基本上不会感染TSE， VRQ/VRQ基因型绵羊对羊痒病最易感，亍旦 不是所有品种的绵羊都有VRQ型PRNP等位基因，例如萨福克羊，而ARQ/ARQ、 VRQ/ARQ、 AHQ/VRH等其它基因型羊则为敏感型，易患TSE(Buschmann A， Luhken G, Schultz J， etal. Neuronal accumulation of abnormal prion protein in sheep carrying a
5scrapie-resistant genotype (PrPARR/ARR)[J]. The Journal of general virology. 2004， 85(9): 2727-2733; Hamir A N, Kunkle R A, Richt J A， et al. Experimental transmission of sheep scrapie by intracerebral and oral routes to genetically susc印tible Suffolk she印in the United States[J"]. J Vet Diagn Invest. 2005， 17(1): 3-9; Baylis， M. ， and K. M. Mclntyre. 2004 . Transmissible spongiform encephalopathies:scrapie control under new strain[J].Nature, 2004， 432(7019) :810 - 9011)。也有研究称含有杂合子VRQ/ARR基因型的羊感染了羊痒病，但 是当有ARR等位基因和非VRQ等位基因伴随时，羊很少有感染羊痒病的报道。
由于羊痒病潜伏期长，不能进行血清学诊断和免疫预防，病死率极高，是一种严重 危害养殖业的疾病。因此它不仅限制了国际间绵羊的贸易，也给本病的控制与消灭带来 了很大难度，对养羊业造成的经济损失很大。2003年5月欧盟出台了在各成员国实施TSE 抗性基因型的研究与筛选工作，其法案号为(EC) N0999/2001,其中的第14条规定各成 员国要根据欧盟的标准来防止、控制和根除羊痒病。而我国尚没有针对TSE抗性基因的快 速筛选平台，现只有通过测序技术来诊断P脂P基因型，但此方法成本较高且时间偏长， 只可用于实验室分析研究，而不能用于日常检测监控。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种安全、准确、快速的传染性羊痒病抗性基 因快速分型检测试剂及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种传染性羊痒病抗性基因快 速分型检测试剂，包含三对特异性引物和七条特异性探针，分别针对羊朊蛋白编码基因
PRNP的第136、 154和171位密码子进行诊断，扩增目标长度分别为136bp、 106bp和 97bp，引物和探针序列为
136位密码子检测用
上游引物136-1: 5， -CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3， 下游引物136-2: 5， -ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3' A型检测探针136-A: 5， -FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3， V型检测探针136-A: 5， -VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3'
154位密码子检测用
上游引物154-1: 5， -GGCAATGACTATGAGGACCG-3，
下游引物154-2: 5， -GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3，
R型检测探针154-R: 5， -FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3，
H型检测探针5' -VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3， 171位密码子检测用上游引物171-1: 5， -CCCAACCAAGTGTACTAC-3'
下游引物17卜2: 5' -TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3，
R型检测探针171-R: 5， -FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3，
H型检测探针171-H: 5' -VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3'
Q型检测探针171-Q: 5' -VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3'。 所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂的制备方法，包括以下步骤 (1)选择决定着对羊痒病抗性/敏感性的羊朊蛋白编码基因PRNP的第136、 154和
171位密码子基因序列保守片段为靶目标，其中包含136位编码氨基酸A的基因片段的扩
增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，为
其中包含136位编码氨基酸V的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 示，为
TGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGTACCGTTACCCCA ACCAAGT
其中包含154位编码氨基酸R的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，为
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含154位编码氨基酸H的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 示，为
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含171位编码氨基酸R的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所 示，为
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位编码氨基酸H的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.6所 示，为
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位编码氨基酸Q的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.7所 示，为CAGTCAAGCAACACACAGTCA
(2) 根据各等位基因特点和引物、探针设计原则，设计引物和探针；
(3) 探针合成同时进行荧光标记，探针5'端的荧光报告基团按照等位基因分别标 记为FAM和VIC， 3，端标记MGB;
(4) 经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，确定反应最佳条件。
所述(4)中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为10ixmol/L， 20wL 体系中加入2uL引物及0.5yL探针，探针的特异性使其可区分等位基因，用于羊痒病 抗性/敏感性基因分型。
所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备在羊痒病抗性基因分型方 面及生产标准化试剂盒中的应用。
本发明的有益效果是研究建立特异、敏感、安全、准确、快速的检测方法，在检 疫、诊断、流行病学研究具有重要意义。通过抽取少量羊血即可对羊痒病的抗性基因进 行检测，达到了活体监测的目的，而且整个过程只需两小时，大大缩短了检测时间，这 不但有利于我国申请无疯牛病国家的认证认可工作，同时可为我国动物及其产品的进出 口提供有利的科学依据。另外，也可縮短我国与西方先进国家间的技术差距，打破西方 国家设置的技术壁垒，建立我国的防范措施和技术壁垒，杜绝敏感性基因型种羊的引入， 从根本上防止此病的传入。再者，它还有利于动物产品及饲料的安全控制，保障人类健 康和公共卫生环境。


图1为重组质粒pET-P54及不同病毒DNA实时荧光PCR曲线。 图2为标准模板荧光定量扩增动力学曲线。 图3为ASFV P54标准曲线。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步详细描述。
一种传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂，包含三对特异性引物和七条^寺异'性 探针，分别针对羊朊蛋白编码基因PRNP的第136、 154和171位密码子进行诊断，矛广增 目标长度分别为136bp、 106bp和97bp,引物和探针序列为
136位密码子检测用
上游引物136-1: 5， -CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3， 下游引物136-2: 5， -ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3， A型检测探针136-A: 5， -FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3， V型检测探针136-A: 5， -VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3，
154位密码子检测用
上游引物154-1: 5， -GGCAATGACTATGAGGACCG-3'下游引物154-2: 5， -GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3，
R型检测探针154-R: 5， -FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3，
H型检测探针154-H: 5， -VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3' 171位密码子检测用
上游引物17卜1: 5， -CCCAACCAAGTGTACTAC-3，
下游引物171-2: 5， -TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3，
R型检测探针171-R: 5， -FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3，
H型检测探针171-H: 5， -VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3，
Q型检测探针171-Q: 5， -VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3，。
所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂的制备方法，由以下步骤组成 (1)选择决定着对羊痒病抗性/敏感性的羊朊蛋白编码基因PRNP的第136、 154和 171位密码子基因序列保守片段为靶目标，其中包含136位编码氨基酸A的基因片段的扩 增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，为
其中包含136位编码氨基酸V的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，为
TGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGTACCGTTACCCCA ACCAAGT
其中包含154位编码氨基酸R的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，为
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含154位编码氨基酸H的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.4所 示，为
ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC
其中包含171位编码氨基酸R的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 5戶"
示，为
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位编码氨基酸H的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 6朋: 示，为CAGTCAAGCAACACACAGTCA
其中包含171位编码氨基酸Q的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.7所 示，为
CAGTCAAGCAACACACAGTCA
(2) 根据各等位基因特点和引物、探针设计原则，设计引物和探针；
(3) 探针合成同时进行荧光标记，探针5'端的荧光报告基团按照等位基因分别标 记为FAM和VIC， 3，端标记MGB;
(4) 经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，确定反应最佳条件。
所述(4)中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为10ymol/L， 20uL 体系中加入2wL引物及0.5uL探针，探针的特异性使其可区分等位基因，用于羊痒病 抗性/敏感性基因分型。
所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备在羊痒病抗性基因分型方 面及生产标准化试剂盒中的应用。 实施例l羊基因组DNA的提取
发明中使用的各基因型羊基因组DNA模板为意大利Institut zooprofilattic speriraen DELLA SARDEGNA惠赠，按照Roche旋转柱DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA。
实施例2 PRNP等位基因第136、 154和171位密码子检测引物及探针的设计与合成
根据(GenBank收录号AY907689) P脂P基因序列设计PRNP编码区第136位(A)密码 子的MGB探针及引物；根据(GenBank收录号AY907685) PRNP基因序列设计P脂P编码 区第136位(V)密码子的MGB探针及引物；根据(GenBank收录号AY907685) PRNP基因 序列设计PRNP编码区第154位(R)密码子的MGB探针及引物；根据(GenBank收录号 AY822666. 1) PRNP基因序列设计PRNP编码区第154位(H)密码子的MGB探针及引物；根 据(GenBank收录号AB373795. 1) PRNP基因序列设计PRNP编码区第171位(R)密码子的 MGB探针及引物；根据(GenBank收录号AY907683) PRNP基因序列设计PRNP编码区第 171位(H)密码子的MGB探针及引物;根据(GenBank收录号AY907685) PRNP基因序列 设计P脂P编码区第171位(Q)密码子的MGB探针及引物;探针5'端的荧光报告基团按照 等位基因分别为标记为FAM和VIC， 3'端标记MGB，探针及引物序列如下
136位密码子检测用
上游引物136-1: 5， -CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3， 下游引物136-2: 5， -ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3， A型检测探针136-A: 5， -FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3'V型检测探针136-A: 154位密码子检测用
上游引物154-1: 5， 下游引物154-2: 5，
R型检测探针154-R: H型检测探针154-H:
171位密码子检测用
上游引物171-1: 5' 下游引物171-2: 5'
R型检测探针171-R: H型检测探针:171-H: Q型检测探针171-Q:
5， -VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3，
-GGCAATGACTATGAGGACCG-3'
-GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3'
5， -FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3'
5' -VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3'
-CCCAACCAAGTGTACTAC-3'
-TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3'
5，-層-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3，
5' -VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3'
5， —VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3'
所有引物委托invitrogen公司合成，探针委托Applied Biosystems合成c
实施例3目的基因的实时荧光PCR扩增
基因扩增预混液Taqman Universal PCR MasterMix购于Applied Biosystems i式剂 公司，实时荧光定量PCR仪是Roche LightCycler 480型，荧光PCR管(板)和管盖(封 口膜)购自Roche公司。
1 PCR反应混合液的配制
以实施例1中提取的DNA为模板，以实施例2中设计的各种荧光引物及探针进行荧 光定量PCR反应，选取20 P L如下PCR反应体系
模板DNA: 2uL;上游引物(lOumol/L) : 2uL;下游引物(10umol/L) : 2nL; FAM标记的探针(lOuraol/L) : 0. 5uL; VIC标记的探针(10ixmol/L) : 0. 5uL; 2Xmastermix: lOixL;双蒸水补齐。
136的上下游引物及136A和136V探针为一个检测体系，用来鉴别136等位基因密码 子A和V; 154的上下游引物及154R和154H探针为一个检测体系，用来鉴别154等位基 因密码子R和H; 171的上下游引物及171R和171H探针为一个检测体系，用来鉴别171 等位基因密码子R和H; 171的上下游引物及171R和171Q探针为一个检测体系，用来鉴 别171等位基因密码子R和Q， 171的两个检测体系相结合，可判定被测羊的171 <立密码 子(R/H/Q)类型。
2 PCR反应程序为 50°C 反应10min; 95°C 预变性10min;95°C 变性15s，
60°C 退火延伸lmin，共40个循环；
退火、延伸阶段采集数据。
3结果分析
在Roche公司提供的分析软件Roche LightCycler 480中输入两个检测通道 483-533nm和523-568nm，分别检测FAM和VIC信号。以136位检测体系为例，若样品种 含有如SEQ ID NO. 1所示序列，在483-533nm通道(FAM)即可检测出阳性扩增曲线，亦 说明该被测样本含有编码136A的等位基因，同样，若样品种含有如SEQ IDN0.2所示序 列，在523-568nm通道(VIC)即可检测出阳性扩增曲线，亦说明该被测样本含有编码136V 的等位基因。从图1和图2可见，扩增曲线呈现典型的S型荧光定量动力学曲线。荧光 定量动力学曲线基线平整，无引物二聚体产生；对数区较明显，斜率大且固定(为平行 线)，为较理想的扩增曲线，表明本发明设计的引物和探针完全符合实时荧光定量PCR 的要求。图1中扩增曲线从右边起由上至下依次对应标准品136AA， 154RR， 171RR， 154RH， 171RQ， 136VA, 171RH, 136VV， 154冊，171HQ， 171HQ, 171QQ， 171HH及阴性对照；图2 中扩增曲线从右边起由上至下依次对应标准品154HH, 136VV， 171HQ, 171QQ, 171HH, 154RH， 171HQ， 171RQ， 136VA， 171朋，136AA， 154RR， 171RR及阴性对照。
实施例4羊痒病抗性基因的分型 1检测底物的制备
以实施例3的扩增产物为检测底物。 2检测条件
61°〇预热ls， 6(TC连续读板，同时收集5个信号，收集波长为483-533nm通道(FAM) 和523-568nm通道(VIC)。 3结果分析
在Roche公司提供的分析软件Roche LightCycler 480中选择EndPoint Genotyping 模式，在483-533咖通道和523-568nm通道连续收集信号，机器将根据记录的数据将两 种荧光信号进行比较计算，自动分型。结果如图3所示，横坐标表示483-533nm通道检 测到的荧光值，也就是FAM标记对应的探针所检测到的等位基因密码子荧光值，g;l坐标 表示523-568nra通道检测到的荧光值，也就是VIC标记对应的探针所检测到的等4立基因 密码子荧光值。靠近横坐标的点2为只能检测出FAM荧光信号的纯合子，其对应f示准品 基因型从左至右依次为136AA， 154HH, 171RR;靠近纵坐标的点1为只能检测出VIC荧光 信号的样品，多为纯合子，另外，由于171密码子需要由两套检测体系才能确定其基因 型，故均标记VIC荧光染料的探针对应的基因型171HQ也属于此列，图中点1对应标准 品基因型从上至下依次为171QQ, 136VV， 154HH, 171HQ, 171HQ， 171HH;位于坐标轴对 角线附近的点3对于FAM和VIC两种荧光信号都能检出，其被检物为杂合子，图中对应标准品基因型从上至下依次为154RH, 136VA, 171RH, 171RQ;圆点4为阴性对照。
本发明设计使用的引物及探针，建立了快速简便、特异性强、灵敏度高的传染性羊
痒病抗性基因分型检测体系，可用于传染性羊痒病抗性基因分型的快速检测，检测时间
仅为数小时，可用于常规实验室诊断方法，并作为出入境检验检疫部门对活羊引入的检
测项目，以杜绝羊痒病敏感型品种传入
本发明以意大利Institut zo叩rofilattic sperimen DELLA SARDEGNA惠赠的
PRNP136、 154和171密码子各种基因型阳性模板为对照，采用终点读板基因分型模式 (Endpoint Genotyping)，得到基因分型散点图(见图3)。各标准品均按其基因型表现
为纯合子(136AA、 136VV、 154RR、 154HH、 171RR、 171HH、 171QQ)及杂合子(136VA、
154RH、 171RH、 171RQ和17mQ)，说明引物及探针设计的特异性完全能够用于等位基
因分型快速分析。
本研究平台的建立，通过抽取少量羊血即可对羊痒病的抗性基因进行检测，达到了 活体监测的目的，而且整个过程只需两小时，不需测序鉴定基因型所必须进行的扩增克 隆等步骤，不但降低了生物危害性，而且大大缩短了检测时间，这不但有利于我国申请 无疯牛病国家的认证认可工作，同时可为我国动物及其产品的进出口提供有利的科学依 据。另外，也可縮短我国与西方先进国家间的技术差距，打破西方国家设置的技术壁垒， 建立我国的防范措施和技术壁垒，杜绝敏感性基因型种羊的引入，从根本上防止此病的 传入。再者，它还有利于动物产品及饲料的安全控制，保障人类健康和公共卫生环境。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以 在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
序列表(SEQUENCE LISTING) 〈110〉天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 〈120>传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备方法和应用 〈160〉 7
〈170〉 Paiteritln version 3. 5
〈210〉 1 〈211〉 893 〈212〉 腿〈213> 绵羊(0vis aries)
〈220>
<221〉 allele
〈222〉 (428). . (563)
<223> 136位密码子编码丙氨酸的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号AY907689
〈400〉 1
tgctgcagac tttaagtgat ttttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatgg鄉tggctggggc caacctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtcaagg 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tggg犯gtgc ■
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540
catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg gagcgagtgg tggagcaaat 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caamgggggg caagtgtgat 780cctsttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840 ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
<210> 2
<211> 893
〈212〉 DNA
〈213〉 绵羊(Ovis aries)
〈220〉
〈221〉 allele <222> (428). . (563)
<223> 136位密码子编码缬氨酸的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号AY907685
〈400〉 2
tgctgcagac tttaagtgat tcttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgacca朋a cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatggagg tggctggggc c認ctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc CEitggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtc卿g 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tgggaagtgt 480
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg gagcgagtgg tggagca朋t 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caaagggggg caagtgtgat 780
cctcttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840
ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
〈210〉 3
〈211〉 893
〈212〉 腿
〈213〉 绵羊(Ovis aries)
<220>
〈221〉 allele
〈222〉 (505)..(612)
〈223〉 154位密码子编码精氨酸的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号AY907685
〈400〉 3
tgctgcagac ttt幼gtgat tcttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtxagc cccatggagg tggctggggc caacctcatg gaggtggctg 300gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtcaagg 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccUggt ggctacatgc tgggaagtgt ■
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540
catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg gagcgagtgg tggagcaaat 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caaagggggg caagtgtgat 780
cctcttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840
ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
〈210〉 4
<211〉 176
〈212〉 腿
〈213> 绵羊(Ovis aries)
〈220〉
〈221〉 allele 〈222〉 (54). (159)
〈223〉 154位密码子编码组氨酸的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号AY822666. 1 〈400〉 4
ggccttggtg gctacatgct gggaagtgcc atgagcaggc ctcttataca ttttggcaat 60gactatgagg accgttacta tcatgaaaac atgtaccgtt accccaacca agtgtactac 120 agactagtgg atcagtatag taaccagaac aactttgtgc atgactgtgt caacat 176
<210> 5
〈211〉 402
〈212〉 腿
<213> 绵羊(Ovis aries)
<220>
〈221〉 allele 〈222〉 (201).. (297)
<223〉 171位密码子编码精氨酸的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号AB373795. 1
<400〉 5
ggtcaaggtg gtagccacag tcagtggaac aagcccagta agccaaaaac caacatgaag. 60
catgtggcag gagctgctgc agctggagca gtggtagggg gccttggtgg ctacatgctg 120
ggaagtgcca tgagcaggcc tcttatacat tttggcaatg actatgagga ccgttactat 180
cgtgaaaaca tgtaccgtta ccccaaccaa gtgtactaca gaccagtgga tcggtatagt 240
aaccagaaca actttgtgca tgactgtgtc aacatcacag tcaagcaaca cacagtcscc 300
accaccacca agggggagaa cttcaccgaa actgacatca agataatgga gcgagtggtg 360
gagcaaatgt gcatcaccca gtaccagaga gaatcccagg ct 402
〈210〉 6 〈211> 893 <212> DNA〈213〉 绵羊(0vis aries)
〈220>
〈221〉 allele 〈222> (553).. (650)
〈223〉 171位密码子编码组氨酸的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号:AY907683
<400〉 6
tgctgcagac tttaagtgat ttttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatggagg tggctggggc c認ctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtc卿g 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaa犯accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tgggaagtgc ■
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540
catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcattata gtaacceLgaa 600
caactttgtg catgactgtg tcaacatcac agtcaagcaa cacacagtca ccaccaccac 660
caagggggag aacttcaccg朋actgacat caagataatg gagcgagtgg tggagcaaat 720
gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac caacgggggg caagtgtgat 780cctgttttct tcccctcctg tgatcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840 ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 893
〈210〉 7
<211〉 893
〈212〉 腿
<213〉 绵羊(0vis aries)
<220〉
<221〉 allele <222> (553).. (650)
〈223〉 171位密码子编码谷酰胺的朊蛋白基因，序列来自GenBank，编号AY卯7685
〈400〉 7
tgctgcagac tttaagtgat tcttacgtgg gcatttgatg ctgacaccct ctttattttg 60
cagagaagtc atcatggtga aaagccacat aggcagttgg atcctggttc tctttgtggc 120
catgtggagt gacgtgggcc tctgcaagaa gcgaccaaaa cctggcggag gatggaacac 180
tggggggagc cgatacccgg gacagggcag tcctggaggc aaccgctatc cacctcaggg 240
agggggtggc tggggtcagc cccatggagg tggctggggc c朋cctcatg gaggtggctg 300
gggtcagccc catggtggtg gctggggaca gccacatggt ggtggaggct ggggtcaagg 360
tggtagccac agtcagtgga acaagcccag taagccaaaa accaacatga agcatgtggc 420
aggagctgct gcagctggag cagtggtagg gggccttggt ggctacatgc tgggaagtgt 480
catgagcagg cctcttatac attttggcaa tgactatgag gaccgttact atcgtgaaaa 540catgtaccgt taccccaacc aagtgtacta cagaccagtg gatcagtata gtaaccagaa 600caactttgtg catgactgtg tc犯catcac agtcaagcaa cscacagtca ccaccaccac 660caagggggag aacttcaccg aaactgacat caagataatg g兆cg3gtgg tggsgca犯t 了20gtgcatcacc cagtaccaga gagaatccca ggcttattac c犯agggggg caagtgtgat 780cctcttt"tct tcccctcctg tga"tcctcct catctctttc ctcatttttc tcatagtagg 840ataggggcaa ccttcctgtt ttcattatct tcttaatctt tgccaggttg ggg 89权利要求
1、一种传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂，其特征在于，包含三对特异性引物和七条特异性探针，分别针对羊朊蛋白编码基因PRNP的第136、154和171位密码子进行诊断，扩增目标长度分别为136bp、106bp和97bp，引物和探针序列为136位密码子检测用上游引物136-15’-CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3’下游引物136-25’-ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3’A型检测探针136-A5’-FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3’V型检测探针136-A5’-VIC-CTCATGACACTTCC-MGB-3’154位密码子检测用上游引物154-15’-GGCAATGACTATGAGGACCG-3’下游引物154-25’-GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3’R型检测探针154-R5’-FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB-3’H型检测探针154-H5’-VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3’171位密码子检测用上游引物171-15’-CCCAACCAAGTGTACTAC-3’下游引物171-25’-TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3’R型检测探针171-R5’-FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3’H型检测探针171-H5’-VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3’Q型检测探针171-Q5’-VIC-ACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3’。
2、权利要求1所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂的制备方法，其特征 在于，包括以下步骤(1)选择决定着对羊痒病抗性/敏感性的羊朊蛋白编码基因PRNP的第136、 154和 171位密码子基因序列保守片段为靶目标，其中包含136位编码氨基酸A的基因片段的扩 增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示，为其中包含136位编码氨基酸V的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 示，为其中包含154位编码氨基酸R的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，为-ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC其中包含154位编码氨基酸H的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID N0.4所 示，为ATCAGTATAGTAACCAGAACAACTTTGTGC其中包含171位编码氨基酸R的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所 示，为CAGTCAAGCAACACACAGTCA其中包含171位编码氨基酸H的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所 示，为CAGTCAAGCAACACACAGTCA其中包含171位编码氨基酸Q的基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所 示，为CAGTCAAGCAACACACAGTCA(2) 根据各等位基因特点和引物、探针设计原则，设计引物和探针；(3) 探针合成同时进行荧光标记，探针5'端的荧光报告基团按照等位基因分别标 记为FAM和VIC， 3'端标记MGB;(4) 经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，确定反应最佳条件。
3、 根据权利要求2所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂的制备方法，其 特征在于，所述(4)中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为10ixmol/L， 20y L体系中加入2 u L引物及0. 5 y L探针，探针的特异性使其可区分等位基因，用于羊 痒病抗性/敏感性基因分型。
4、 权利要求1所述的传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂在羊痒病抗性基因分 型方面及生产标准化试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种传染性羊痒病抗性基因快速分型检测试剂及其制备方法和应用，设计合成了三套特异性的引物及Taqman探针，分别针对决定羊痒病抗性/敏感性的羊朊蛋白编码基因PRNP的第136、154和171位密码子进行检测，用来判定被检羊是否含有传染性羊痒病抗性基因。本发明借助实时荧光定量PCR检测体系及其之后的终点读板模式，建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的基因分型方法，检测时间仅为数小时。借助该方法可建立一整套完善的预警监测体系来预防羊痒病的发生，可用于常规实验室诊断方法，并作为出入境检验检疫部门对活羊引入的检测项目，以杜绝羊痒病敏感型品种传入。
文档编号C12Q1/68GK101671727SQ20091007081
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月15日 优先权日2009年10月15日
发明者琳 李, 栾慎顺, 妍 肖, 董志珍, 蔡国瑞, 陈本龙 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心