专利名称：测定昆虫对杀虫剂抗性的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定昆虫对杀虫剂抗性的方法和试剂盒，更具体地提供了用来测定昆虫对含有机磷酸酯和氨基甲酸酯杀虫剂抗性的田间使用的方法和试剂盒。
背景技术：
化学杀虫剂目前仍然是防治如疟疾、登革热、丝虫病等疾病传播媒介的最重要的试剂。自1940年发明第一种合成杀虫剂DDT以后，上述疾病的传播造成的死亡人数已大大减少。可是，持续地使用杀虫剂导致携带上述疾病，主要是昆虫媒介的抗性的发展，昆虫的抗药性降低了防治媒介的效果并因此造成疾病传播。抗性的测定主要是基于世界卫生组织(WHO)的标准试验方法，这些方法对使用者来讲是特别不易使用的，花费时间长，需要许多昆虫样本，使用的试剂盒的货架寿命短并需要熟练的人员进行试验并解释试验结果。结果，一般都不知道许多种昆虫媒介的敏感性水平，而昆虫的敏感性会影响防治的结果。
在防治疾病传播媒介中的一个重大突破应该是开发快速田间试剂盒。
通常，抗性的生化基础是下述3种机理以有机磷酸酯和氨基甲酸酯为靶标的非特定酯酶水平的增加；复合功能的氧化酶对拟除虫菊酯的活性提高；和对有机磷和氨基甲酸酯的非敏感性乙酰胆碱酯酶。
发明内容
本发明提供了使用单个昆虫测定昆虫中乙酰胆碱酯酶敏感性的方法和试剂盒，本方法可快速和简便的使用，且获得的结果非常容易解释。
根据本发明的试剂盒包含一种容器，该容器分别包括下述容器
I.一种中性至酸性pH的磷酸缓冲液II.碘化乙酰基胆碱III.5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)IV.残杀威(一种氨基甲酸酯杀虫剂)和V.水混溶有机溶剂。
用于田间的试剂盒还包括进行试验的设备，例如混合容器、试验试管、如Eppendorf试管、移液管和微检测盘。
缓冲液的pH优选为6-7，更优选大约6.8。
pH缓冲液优选为磷酸钾。
残杀威优选使用5-25mg/l的70％乙醇溶液。
水混溶有机溶剂优选为丙酮。
本发明方法包含下述步骤以任何顺序在缓冲液中将单个昆虫匀浆，优选用杵在如Eppendorf试管的小试管中研磨，在缓冲溶剂中制备碘化乙酰胆碱的溶液，在缓冲液中制备5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)溶液，并在缓冲液中制备残杀威溶液，然后将昆虫匀浆液滴入检测盘的孔中，将碘化乙酰胆碱和5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入一些孔中，并将5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)、碘化乙酰胆碱和残杀威溶液滴入其它孔中，并检测两种细胞样品染色的黄色度的不同。
如果需要可将残杀威和碘化乙酰胆碱溶液预混合。
可用肉眼评价结果，如果需要更准确的结果，可在410nm用免疫测定读数器扫描。
包括残杀威的细胞，如果在保温一段时间后黄色变浅，说明乙酰胆碱酯酶是敏感的，且昆虫对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂是非抗性的。
本发明的优点是最先获得了仅需要单个的昆虫进行测定，就可测定乙酰胆碱酯酶敏感性的田间试剂盒，在试验中使用本方法可以快速获得试验结果(通常在30分钟内获得结果)，且可以不需要仪器，通过目测和比色计读数。本试剂盒和方法花费的人力少且不需要特殊训练即可使用。而且，本试剂盒具有长的货架寿命，可在室温下稳定数周。
应用本试剂盒可以
1.相当简单地测定抗性2.确保用于防治害虫和疾病媒介的化学杀虫剂是有效的，从而减少死亡率、费用和人力3.能够经常和定期地监测靶标昆虫的敏感性和4.对新防治药剂和防治策略的设计进行支持，并理解昆虫的作用方式。
将丙酮倒入碘化乙酰胆碱中并在孔中混合形成溶液，然后向其中加入9ml缓冲液。将其中10ml缓冲液倒入5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)中，并在孔中混合形成溶液，1.8ml碘化乙酰胆碱溶液与4ml缓冲液混合，然后加入0.2ml并在孔中混合。
用杵在Eppendorf试管中用一滴缓冲液中将一只蚊子匀浆，然后用缓冲液稀释到Eppendorf试管的0.5ml标记。将匀浆液静置5分钟使碎片落下后，将一滴匀浆液滴入到四孔检测盘的每个孔中。将一滴未被稀释的碘化乙酰胆碱溶液和一滴5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入2个孔中。一滴残杀威溶液滴入另外两个孔中。然后将一滴5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入到这两个孔中。将盘保温30分钟，然后评价两个系列孔中的样品的颜色。如果在包括残杀威溶液的第二对孔中的黄色，比第一对孔中的要浅，蚊子的乙酰胆碱酯酶是敏感的，且因此对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂不具备抗性。
肉眼检查颜色或在410nm用免疫测定读数器扫描。
权利要求
1.一种用单个昆虫测定乙酰胆碱酯酶敏感性的方法，其中包含下述步骤以任何顺序在中性至酸性pH磷酸缓冲液中将单个昆虫匀浆，在中性至酸性pH磷酸缓冲的水混溶有机溶剂中制备碘化乙酰胆碱的溶液，在缓冲液中制备5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)溶液，并在缓冲液中制备残杀威溶液，将昆虫匀浆液滴入检测盘的孔中，然后将碘化乙酰胆碱和5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入一些孔中，并将5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)、碘化乙酰胆碱和残杀威溶液滴入其它孔中，并在两种系列的细胞样品之间检测黄色度的不同。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于其中使用一种试剂盒，其为分别包括下述容器的一种容器I.一种中性至酸性pH的磷酸缓冲液II.碘化乙酰基胆碱III.5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)IV.残杀威和V.水混溶有机溶剂。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其特征在于其中缓冲液是pH6-7的缓冲液。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于其中缓冲液是pH6.8的缓冲液。
5.根据权利要求1或权利要求2的方法，其特征在于其中缓冲液是磷酸钾。
6.根据权利要求1-5任一的方法，其特征在于其中使用的残杀威是5-25mg/l的乙醇溶液。
7.根据权利要求1-6任一的方法，其特征在于其中残杀威和碘化乙酰胆碱溶液是预混合的。
8.一种使用单个昆虫在昆虫中测定乙酰胆碱酯酶敏感性的试剂盒，其中包含一种容器，该容器分别包括下述容器I.一种中性至酸性pH的磷酸缓冲液II.碘化乙酰胆碱III.5，5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)IV.残杀威V.水混溶有机溶剂。
9.根据权利要求8的试剂盒，其特征在于其中缓冲液是pH6-7的缓冲液。
10.根据权利要求8或权利要求9的试剂盒，其特征在于其中缓冲液是pH6.8的缓冲液。
11.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于其中缓冲液是磷酸钾。
12.根据权利要求8-11任一的试剂盒，其特征在于其中使用的残杀威额是5-25mg/l的乙醇溶液。
13.根据权利要求8-12任一的试剂盒，其特征在于其中还包含进行试验的设备。
14.根据权利要求13的试剂盒，其特征在于其中包含试验试管、移液管和小生测盘。
全文摘要
一种用单个昆虫测定昆虫体中乙酰胆碱酯酶敏感性的方法，其中包含下述步骤以任何顺序在中性至酸性pH磷酸缓冲液中将单个昆虫匀浆，在中性至酸性pH磷酸缓冲的水混溶有机溶剂中制备碘化乙酰胆碱的溶液，在缓冲液中制备5，5－二硫－双－(2－硝基苯甲酸)溶液，并在缓冲液中制备残杀威溶液，将昆虫匀浆液滴入检测盘的孔中，将碘化乙酰胆碱和5，5－二硫－双－(2－硝基苯甲酸)溶液滴入－些孔中，并将5，5－二硫－双－(2－硝基苯甲酸)残杀威溶液滴入其它孔中，并在两部分细胞样品之间检测黄色度的不同。本发明还涉及一种使用单个昆虫在昆虫中测定乙酰胆碱酯酶敏感性的试剂盒，其中包含一种容器，该容器分别包括下述容器I.一种中性至酸性pH的磷酸缓冲液，II.碘化乙酰胆碱，III.5，5－二硫－双－(2－硝基苯甲酸)，IV.残杀威，V.水混溶有机溶剂。
文档编号G01N33/15GK1502982SQ02158930
公开日2004年6月9日 申请日期2002年12月27日 优先权日2002年11月26日
发明者李·汉·林, 纳兹尼·瓦西·艾哈迈德, 瓦西 艾哈迈德, 李 汉 林 申请人:医药研究院