专利名称：：检测瓠瓜白粉病抗性的分子标记方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蔬菜分子遗传育种
技术领域：
，尤其涉及一种利用分子标记技术，准确、快速检测瓠瓜对白粉病抗性的检测方法和与该方法配套使用的试剂盒。
背景技术：
：夸瓜瓜(Lagenariasiceraria(Molina)Standi)白粉病(Powderymildew)，是由单丝壳白粉菌(Sphaerothecafuliginea)侵染引起的一种常见的瓠瓜真菌病害，全国各地以及各种栽培方式下都有发生。该病从苗期至成株期均可为害，尤以生长中、后期危害较重，常造成大量减产和品质下降，给瓠瓜生产造成了严重威胁(司凤举，司越，瓠瓜白粉病的发生与防治，长江蔬菜，2007，7:31)。培育抗病品种是防治瓠瓜白粉病最为安全、有效和经济的措施之一。但是瓠瓜白粉病的发生受环境影响很大，且其病原菌需活体保存，这对在育种过程中必须进行的室内、外菌种接种鉴定带来了很大的不便；同时，目前对该病抗病性的鉴定、分级复杂，且尚无统一的标准。因此，传统的瓠瓜抗白粉病品种育种方法存在有主观性强，准确性低等缺陷；特别是瓠瓜植株的株型较大，依赖对大量材料的表型进行筛查的方法，则更加费时、费地、费力。RFLP、RAPD、AFLP等分子标记技术的问世，为植物育种提供了一条新的途径。分子标记辅助育种(MolecularMarker-assistedSelection,简称MAS)，是借助分子标记技术对育种材料从DNA水平上进行检测与选择，这在生物体的各个组织、各个发育时期均可实施，不受季节、环境的限制，不存在能否表达的问题，从而可快速选择得到具有目的性状的后代(方宣钧，吴为人，唐纪良，作物DNA标记辅助育种.北京科学出版社，2001)。因此，研究开发与瓠瓜白粉病基因连锁的分子标记，并利用该标记快速、稳定、可靠地对抗性基因材料进行检测、筛选，从而显著加快瓠瓜抗白粉病育种的进程，这对瓠瓜抗白粉病育种极具应用价值。在黄瓜、甜瓜等瓜类作物中，有关抗白粉病的分子标记技术已有诸多报道，(刘秀波，崔琦，崔崇士，瓜类白粉病抗性育种研究进展，东北农业大学学报，2005，6:774)，但与瓠瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记及其应用目前尚未见有报道。
发明内容本发明目的在于，针对传统瓠瓜抗白粉病育种方法中所存在的依赖表型抗性鉴定，分级标准不统一，主观性强，准确性低，费时、费地、费力等缺陷，提供一种能快速、准确、低成本鉴定瓠瓜白粉病抗性的分子标记检测方法；本发明另一目的是，提供一种可方便实施上述分子标记检测方法的试剂盒。本发明的主要原理是我们首先通过对瓠瓜抗病亲本、感病亲本及其杂交后代^和F2分离群体的单株白粉病分级鉴定及抗性遗传分析，明确瓠瓜对白粉病的抗性系由一对隐性基因控制；通过筛选也已获得与该瓢瓜白粉病基因紧密连锁的AFLP分子标记为E-ATG/M-CTC，并进而将其转化为基于PCR的，快速、简便、低成本的SCAR标记为Primerl:5，-CATGAAAGAAAATCGGCTTGG-3，，Primer2:5'-TAACTCCAGCACTCCCTTCCC_3，，并交由上海英骏生物技术公司合成引物；基于上述基础，只需通过检测瓠瓜样品材料的基因组内，是否存在有与抗白粉病基因紧密连锁的特异片段，即可确定该材料对瓠瓜白粉病的抗性，如果检测出含特异片段，则说明被检植株为抗病植株；如果反之，则说明被检植株为感病植株。本发明目的通过以下技术方案来实现。检测瓠瓜白粉病抗性的分子标记方法，该方法按以下步骤进行(1)瓢瓜基因组DNA的提取将各待检测瓢瓜样品用CTAB法提取基因组DNA后，分别保存，备用；(2)基因组DNA的PCR扩增将瓢瓜各样品基因组DNA20ng，分别加入各PCR管中，并在各管中再依次加入鉴定瓠瓜白粉病抗性的上、下游引物各0.2M，dNTP0.25mM，MgCl22.OmM，1倍的PCR缓冲液及T叫DNA聚合酶1单位，并加无菌重蒸水至20后，在94°C预变性2min，94。C30seconds，4850。C退火30seconds，72。C延伸60seconds，30个循环，72"C延伸10min下进行扩增，产物4"C保存；所述鉴定瓠瓜白粉病抗性的上游引物序列为5'-CATGAAAGAAAATCGGCTTGG-3';下游引物序列为5'-TAACTCCAGCACTCCCTTCCC-3';(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析各样品分别取扩增产物10iU，并加入由0.25%溴酚兰和40%蔗糖配制而成的上样缓冲液2iU，混匀；将混合物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳；凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；(4)瓠瓜样品白粉病抗性的鉴定依据各样品在凝胶上有无条带的出现，即可确定该样品是否具对白粉病的抗性。检测瓠瓜白粉病抗性的试剂盒，该试剂盒包括盒体和7支PCR管，在5支PCR管中分别装有dNTP，MgCl2，PCR缓冲液，TaqDNA聚合酶和显色剂EB;其中，在另外2支PCR管中分别装有鉴定瓠瓜白粉病抗性的序列为5'-CATGAAAGAAAATCGGCTTGG-3'的上游引物和序列为5'-TAACTCCAGCACTCCCTTCCC-3'的下游引物。本发明的有益效果1、方法简单易行、快速灵敏、结果准确。该方法采用自主开发的引物和实验室常规的PCR技术，从取样到检测完成只需45个小时，且周年均可进行；而常规田间接种鉴定，仅培养幼苗就需要3周左右，接种后一般再需2周左右时间才能见结果，同时，在此期间影响接种成功率的环境因素较多，因此检测结果的准确性就较低。2、该方法通过对遗传物质的检测，方便、重复性好，并在苗期就可进行，能在早期即淘汰大量的感病植株，将后续移栽、管理、鉴定等的工作量减少到最低限度，大量节约了检测成本，仅为传统表型鉴定成本的二十分之一左右。3、本发明所提供的试剂盒，将检测用引物和相关试剂综合组装在一盒内，方便实施操作，检测结果稳定可靠，结合常规的分子生物学设备，就可按提供的操作程序进行实际检测，易于实现标准化，一次可对上百份样品进行检测，检测时间仅需4-5小时，提高了检测的效率和标准化程度。图1.瓠瓜抗白粉病选育各亲本、杂交世代单株苗期抗性鉴定图；M:100bpDNA分子量标准；1为抗病亲本，2为感病亲本，3_14为F2代抗病单株，15为^代单株，16-22为F2代感病单株；图2.瓠瓜不同品种对白粉病抗性鉴定图；M为100bpDNA分子量标准；1为抗病对照，2为感病对照，3、4为地方抗病品种，5、13、16为自选抗病株系；6-12和14、15、17为感病株系。图3.用试剂盒检测不同瓠瓜品种白粉病抗性；M为100bpDNA分子量标准；1为抗病对照，2为感病对照，3、4为地方抗病品种，5自选抗病株系，e-io为自选感病株系。具体实施例方式下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。实施例1:(瓠瓜亲本、巳及F2代单株苗期对白粉病抗性的检测)本例所述瓠瓜材料瓠瓜抗病亲本J083，编号为1;瓠瓜感病亲本杭州长瓜，编号为2代单株编号为15;F2代单株编号为3-14和16-22;检测方法按以下步骤进行1、瓢瓜基因组DNA的提取取瓢瓜抗病、感病亲本和巳、&代各单株样品苗期幼嫩叶片0.1克，加液氮研磨成粉末，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；2、基因组DNA的PCR扩增在各PCR管中分别加入步骤(1)提取的各瓠瓜样品基因组DNA20ng后，再依次加入上下游引物各0.2iiM，dNTP0.25mM，MgCl22.OmM，1倍的PCR缓冲液，TaqDNA聚合酶l单位，加无菌重蒸水至20iil后，按PCR反应程序94。C预变性2min，94°C30seconds，4850。C退火30seconds，72°C60seconds，30个循环进行扩增，72。C延伸10min，产物4t:保存；所述鉴定瓠瓜白粉病抗性的分子标记E-ATG/M-CTC的上游引物序列为5'-CATGAAAGAAAATCGGCTTGG-3';下游引物序列为5'-TAACTCCAGCACTCCCTTCCC-3';3、PCR扩增产物的凝胶电泳分析各样品分别取扩增产物10iU和由0.25%溴酚兰加40%蔗糖配制而成的上样缓冲液2iU，混匀，将混合物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；4、瓠瓜样品白粉病抗性的鉴定根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品对白粉病的抗性(见图l):其中，抗病亲本l和抗病单株3-14均扩增出75bp条带，而感病亲本2、^代单株15和感病单株16-22均未扩增出相应条带，扩增结果表明本方法鉴定结果与田间传统表型鉴定吻合率达到95%左右，而且具有快速、准确、不受外界环境限制等优点。实施例2:(不同瓠瓜品种对白粉病抗性的检测)本例所述瓠瓜材料抗病对照品种J083，编号为1;感病对照品种杭州长瓜，编号为2;地方抗病品种腰葫芦、牛腿蒲，编号为3、4;自选抗病株系编号为5_7和10、11;自选感病株系编号为8-9和12-16;检测方法按以下步骤进行1、瓠瓜基因组DNA的提取取待检测瓠瓜样品苗期幼嫩叶片各O.l克，加液氮研磨成粉末，按CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；2、基因组DNA的PCR扩增在各PCR管中分别加入步骤(1)提取的各瓠瓜样品基因组DNA20ng后，再依次加入上、下游引物各0.2iiM，dNTP0.25mM，MgCl22.OmM，1倍的PCR缓冲液，T叫DNA聚合酶1单位，加无菌重蒸水至20ul;扩增条件、程序同实施例1;3、PCR扩增产物的凝胶电泳分析各样品分别取扩增产物10iU和由0.25%溴酚兰加40%蔗糖配制而成的上样缓冲液2iU，混合，将混合物在2.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，具体工艺同实施例1;4、瓠瓜样品白粉病抗性的鉴定根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品对白粉病的抗性(见图2)，其中，抗病对照品种l和地方抗病品种3、4及自选抗病株系5-7和10、11均扩增出一条75bp的条带，而感病对照品种2和自选感病株系8-9和12-16均未扩增出相应条带。实施例3:(采用本发明试剂盒对不同瓠瓜品种白粉病抗性的检测)本例所述瓠瓜材料抗病对照品种J083，编号为1;感病对照品种杭州长瓜，编号为2;地方抗病品种腰葫芦、牛腿蒲，编号为3、4;自选抗病株系，编号5;自选感病株系编号为6-10.检测方法按以下步骤进行1、瓠瓜基因组DNA的提取取待检测瓠瓜样品苗期幼嫩叶片各O.l克，加液氮研磨成粉末，按CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；2、基因组DNA的PCR扩增用试剂盒提供的试剂和引物进行PCR扩增，扩增体积为20ii1;加入模板DNA20ng，上下游引物各0.2iiM，dNTP0.25mM，MgCl22.OmM，1倍的PCR缓冲液，T叫DNA聚合酶1单位，加无菌重蒸水至20iU，扩增条件、程序同实施例1;3、PCR扩增产物的凝胶电泳分析各样品分别取扩增产物10iil和由0.25%溴酚兰加40%蔗糖配制而成的上样缓冲液2iU，混合，将混合物在2.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，利用试剂盒提供的显色剂显色后用凝胶成像系统进行观察、照相；4、瓠瓜样品白粉病抗性的鉴定根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品对白粉病的抗性(见图3)。实施例4:(本发明检测方法与传统接种鉴定方法的对比试验)本发明方法所用材料与步骤同实施例1;传统接种鉴定方法所用材料同实施例1，方法按以下步骤进行1、分别取待测品种和对照品种种子播种于营养钵中，出苗后每个营养钵留一株，每品种100株以上；2、苗期日常管理按常规栽培技术进行；3、于四叶一心期采用瓠瓜白粉病孢子悬浮液进行接种，10-15天后调查病情，每株调查5张叶片上的孢子堆数，计算病情指数；统计病情指数后确定各材料的抗感性。本发明方法鉴定品种抗性与传统接种鉴定方法的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>序列表〈110〉浙江省农业科学院〈120〉检测瓠瓜白粉病抗性的分子标记方法及其试剂盒〈160>21〈210>1〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作E-ATG/M-CTC分子标记的上游引物〈400〉1CATGAAAGAAAATCGGCTTGG21〈210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作E-ATG/M-CTC分子标记的下游引物〈400>2TAACTCCAGCACTCCCTTCCC2权利要求检测瓠瓜白粉病抗性的分子标记方法，其特征在于按以下步骤进行(1)瓠瓜基因组DNA的提取将各待检测瓠瓜样品用CTAB法提取基因组DNA后，分别保存，备用；(2)基因组DNA的PCR扩增将瓠瓜各样品基因组DNA20ng，分别加入各PCR管中，并在各管中再依次加入鉴定瓠瓜白粉病抗性的上、下游引物各0.2μM，dNTP0.25mM，MgCl22.0mM，1倍的PCR缓冲液及TaqDNA聚合酶1单位，并加无菌重蒸水至20μl后，在94℃预变性2min，94℃30seconds，48～50℃退火30seconds，72℃延伸60seconds，30个循环，72℃延伸10min下进行扩增，产物4℃保存；所述鉴定瓠瓜白粉病抗性的上游引物序列为5’-CATGAAAGAAAATCGGCTTGG-3’；下游引物序列为5’-TAACTCCAGCACTCCCTTCCC-3’；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析各样品分别取扩增产物10μl，并加入由0.25％溴酚兰和40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μl，混匀；将混合物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳；凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；(4)瓠瓜样品白粉病抗性的鉴定依据各样品在凝胶上有无条带的出现，即可确定该样品是否具对白粉病的抗性。2.检测瓠瓜白粉病抗性的试剂盒，该试剂盒包括盒体和7支PCR管，在5支PCR管中分别装有dNTP，MgCl2，PCR缓冲液，TaqDNA聚合酶和显色剂EB，其特征在于在另外2支PCR管中分别装有鉴定瓠瓜白粉病抗性的序列为5'-CATGAAAGAAAATCGGCTTGG-3'的上游引物和序列为5'-TAACTCCAGCACTCCCTTCCC-3'的下游引物。全文摘要本发明公开了检测瓠瓜白粉病抗性的分子标记方法及其试剂盒，属于蔬菜分子遗传育种
技术领域：
。方法包括(1)瓠瓜基因组DNA的提取；(2)PCR扩增；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；和(4)瓠瓜样品白粉病抗性的鉴定等步骤。只需通过检测瓠瓜样品材料的基因组内，是否存在有与抗白粉病基因紧密连锁的特异片段，即可确定该材料是否具对瓠瓜白粉病的抗性。该方法具简单易行、快速灵敏、结果准确、成本低廉等特点，检测过程只需4～5小时，而成本仅为传统表型鉴定的二十分之一左右。可在蔬菜育种、种子鉴定部门推广应用。文档编号C12Q1/68GK101701249SQ20091015427公开日2010年5月5日申请日期2009年11月19日优先权日2009年11月19日发明者刘永华,吴晓花,徐沛,李国景,汪宝根,王玲平,鲁忠富申请人:浙江省农业科学院