甜瓜mlo型抗白粉病基因快速鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是借助于甜瓜测序全基因组序列，利用植物比较基因组学、遗传学、生物信 息学和候选基因策略等方法快速鉴定甜瓜白粉病基因，主要涉及到甜瓜全基因组序列的下 载，候选基因的鉴定，基因的比对，聚类等手段，进而鉴定出白粉病基因，属于植物生物技术 科学领域。
【背景技术】
[0002] 甜瓜又称甘瓜或香瓜。甜瓜因味甜而得名，由于清香袭人故又名香瓜。甜瓜是夏令 消暑瓜果，其营养价值可与西瓜媲美。据测定，甜瓜除了水分和蛋白质的含量低于西瓜外， 其他营养成分均不少于西瓜，而芳香物质、矿物质、糖分和维生素 C的含量则明显高于西 瓜。多食甜瓜，有利于人体心脏和肝脏以及肠道系统的活动，促进内分泌和造血机能。祖国 医学确认甜瓜具有"消暑热，解烦渴，利小便"的显著功效。白粉病严重危害甜瓜的生产，从 苗期到收获期均可受害，尤以生长后期受害最重。主要为害叶片。初在叶面上现白色霉斑， 后渐向四周扩展，形成近圆形斑块，条件适宜时，霉斑扩展十分迅速，病斑相互融合成一片， 致整个叶片覆满一层白粉状物，严重的瓜面上也可长出白色粉状物。目前在生产中，甜瓜白 粉病的防治主要靠喷洒杀菌剂，但长期使用药物会导致环境污染和病菌生理小种变异，因 此推广抗病品种是最安全有效的方法。
[0003] MLO型抗病基因是植物中一类特异的抗病基因。研究者最早发现MLO基因对白粉 病抗性是始于1937-1938年，德国人在埃塞俄比亚采集了很多品种的大麦，其中的两个株 系对白粉病菌（Blumeria.graminisf.sp.hexlei，Bgh)所有已知的生理小种都具有高效抗 性。进一步研究表明，大麦中MLO基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有已知大麦白 粉病菌的生理小种产生持久、广谱的抗性。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因对植物抗白 粉病育种具有重要的意义。目前，克隆植物抗病基因的方法主要有转座子标签法、图位克隆 法等。因此，如何快速鉴定甜瓜的MLO型抗病基因将成为甜瓜抗白粉病育种的重要前提。
[0004] 植物比较基因组学（Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序获得的信 息推测其他生物基因组的基因数目、位置、功能、表达机制和物种进化的学科。利用模式植 物基因组与其它植物基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆其他植物基因，揭示 基因功能和分子机制，阐明物种进化关系及基因组的内在结构，能够更快的推进对可可树 的白粉病的防治。植物比较基因组学的重要性在于它把不同的学科、不同的生物种类联系 在一起，架起了基础研究和应用研究之间的桥梁。跨种、跨属、跨界的基因组比较对我们了 解基因及基因组的结构、基因结构与功能的关系及DNA变化如何导致生物多样性等有十分 重要的意义。
[0005] 本专利所采用的方法及思路：模式植物拟南芥基因组研究已经揭示了 MLO型基因 的功能，利用基因其顺序上的同源性克隆甜瓜MLO型抗病基因，根据模式植物拟南芥实验 系统上的优越性和已知MLO型抗病基因的特点，快速"捕捉"甜瓜抗白粉病基因。本专利介 绍了以甜瓜全基因组序列为前提，结合比较基因组学、遗传学、基因组学、生物信息学和候 选基因策略等知识，快速挖掘白粉病基因。
【发明内容】
[0006] 技术问题
[0007] 本发明的目的是提供一种通过结合植物比较基因组学、植物遗传学、基因组学和 生物信息学等知识，快速挖掘甜瓜抗白粉病基因。其结果一方面可用于甜瓜白粉病基因紧 密连锁分子标记的开发，进行分子标记辅助选择育种，另一方面也为其他作物白粉病基因 鉴定提供参考依据。
[0008] 技术方案
[0009] 主要原理：第一个植物抗白粉病基因（MLO)是从大麦中克隆的，研究发现此基因 是一类特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多数NBS(nucleotide-binding site)类型抗 病基因；随后，研究者相继从番茄、拟南芥、豌豆、辣椒、百脉根等植物中克隆了白粉病基因， 研究发现这些基因编码的都是MLO型抗病基因。随后，众多研究者通过多次试验证实MLO 型抗病基因已经成为植物特有的一类抗白粉病基因。进一步发现，植物MLO类型基因是一 个基因家族；而且对来源于不同物种的MLO基因家族进行系统发育关系分析发现，不同物 种中抗白粉病基因总是聚类一起，成为一类，这一类MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。甜瓜基因组测序的完成为挖掘白粉病基因提供了一条便利途径。因此，可以借 助于已经测序的甜瓜全基因组中MLO基因家族和已经克隆的MLO白粉病基因的系统发育关 系以及对于维持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性来鉴定甜瓜白粉病基因。
[0010] 主要步骤如下：
[0011] 1)甜瓜全基因组序列的下载及其MLO型基因的采集
[0012] 首先从甜瓜测序基因组数据库（http: // melonomics.net /)下载甜瓜全基因 组序列；使用"DNAT00LS"软件对获得的甜瓜全基因组氨基酸序列数据建立数据库，然后用 pfam 数据库（蛋白家族数据库，http: // pfam.janelia.org/search / sequence)中的 隐马尔可夫模型（HMM)对MLO结构域的氨基酸序列与已建立的甜瓜全基因组氨基酸序列数 据库进行Blastp (E-value=0. 001)序列比对，初步筛选出候选基因序列。其次，利用已经公 布的MLO型基因序列，对甜瓜基因组数据库进行BLAST比对，获得候选基因序列。
[0013] 2)甜瓜MLO型基因家族的鉴定
[0014] 将上述结果中得到的同源氨基酸序列的候选基因，通过Pfam(E-Value=LO)进行 分析，去除无 'ML0'结构域的基因序列（图1)。再将候选抗病基因序列通过MEGA3. 1软件 提供的ClustalW工具（多序列比对程序）进行多序列比对，去除重复序列。
[0015] 3)通过植物MLO型基因的系统发育关系鉴定候选的甜瓜MLO型白粉病基因
[0016] 由于先前的研究已经证明，双子叶植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系统 发育树同一区组，因此在系统发育关系研究中，我们把拟南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和甜瓜MLO型基因一起聚类分析，以获得候选的甜瓜抗白粉 病基因（图2)。
[0017] 4)甜瓜白粉病基因与已知的植物MLO白粉病基因的比对
[0018] 利用Bi〇XM2. 6软件将甜瓜候选的MLO型白粉病基因和拟南芥、番茄、豌豆、大麦的 MLO白粉病基因的氨基酸序列转换成Fasta格式的文件，将这些文件导入Bi〇Edit7. 0软件， 运用此软件中Clustal软件进行多序列比对，揭示候选白粉病基因重要氨基酸残基及区域 的保守性。从而进一步鉴定甜瓜候选的白粉病基因（图3)。
[0019] 本发明的积极效果：
[0020] 1)缩短了甜瓜白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定。采用常规方 法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。本 发明基于植物比较基因组学、遗传学、生物信息学方法快速挖掘甜瓜白粉病基因，不仅可以 缩短时间，还可以提高白粉病基因鉴定效率。
[0021] 2)甜瓜（Cucumis melo)是全世界重要蔬菜之一。由于甜瓜遗传基础狭窄，种质资 源多样性低，因此通过常规的分子标记（rapd、issr、ssr、aflp等）鉴定甜瓜白粉病基因比 较困难。通过鉴定的候选白粉病基因开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以 快速的用于抗病基因的分子标记辅助选择，准确性高。
[0022] 3)多抗性育种材料的创制。基于新鉴定的白粉病基因开发的功能性分子标记，结 合已经定位的其他抗病基因的分子标记，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种年限， 提1?育种效率。
[0023] 4)为阐述甜瓜抗白粉病分子机制奠定了基础。甜瓜抗白粉病基因的鉴定，通过转 基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究 抗白粉病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述甜瓜抗白粉病的作用机理。
【附图说明】
[0024] 图1甜瓜MLO基因的鉴定；
[0025] 本图显示的是14个MLO型基因鉴定结果，每一个基因都含有一个'ML0'保守结构 域。
[0026] 图2植物MLO基因家族的系统发育关系分析及其甜瓜MLO型白粉病基因的鉴定；
[0027] 拟南芥是植物科学研究的模式植物，在构建系统发育树中，拟南芥的15个MLO型 基因（其中3个基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SlMLO)、大麦白粉病基因（HvMLO)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被选择用来和甜瓜MLO型 基因聚类分析。共鉴定出3个甜瓜候选的MLO型白粉病基因。图中斜体标记的基因就是候 选甜瓜白粉病基因。
[0028] 图3甜瓜MLO型白粉病基因的比对分析；
[0029] 3个甜瓜白粉病基因与大麦（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、拟南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)进行比对，鉴定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸残基 和区域的保守型。图中TM1-TM7表示甜瓜MLO型白粉病基因的7个转模区域；黑色圆点表 示白粉菌侵染重要的氨基酸残基；CaMBD表示钙调蛋白结合区；I和II表示对白粉菌侵染 重要的氨基酸区域。
【具体实施方式】
[0030] 抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本 方法可以快速鉴定出甜瓜白粉病基因。具体实施过程如下：
[0031] 1)甜瓜MLO型基因的采集及鉴定
[0032] 为了获得甜瓜全部的MLO型基因家族成员，我们首先以拟南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、辣椒、蔷薇、辣椒、百脉根的抗白粉病MLO基因序列构建HMM模型，从甜瓜基因组序 列中收索MLO型基因；其次以不同作物中已经发表的MLO基因序列作为靶序列（来自DFCI 数据库：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947,