与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列 分子标记及其获取方法。
【背景技术】
[000引甜瓜（化cumis melo L.)是葫芦科甜瓜属一种重要水果型蔬菜作物，国内外栽培 普遍；甜瓜是我国高端农业的优势作物，对农民增收与农业结构调整有着重要意义。白粉病 是一种严重危害甜瓜生产的世界性病害，从苗期至收获期均可发生。白粉病主要危害甜瓜 的叶片，也侵染叶柄和茎蔓，可导致植株光合能力下降，引起早衰甚至死亡，严重影响甜瓜 的产量和品质。近年来，随着生产的规模化和商品化程度的提高，白粉病迅速蔓延，已成为 国内外甜瓜等瓜类作物绿色生产的主要障碍。
[0003] 引起甜瓜白粉病的病原菌主要有单囊壳白粉菌（Podos地aera xanthii)和二抱白 粉菌（Golovinomyces cichoracearum)，其中W单囊壳白粉菌（P.xanthii)占主导。甜瓜白 粉病菌生理小种多，分化快，仅P. xanthii常见生理小种就多达7个，包括0、1、2US、2F、3、 4、5,其中P.xanthii 2F是国内大部分地区的优势生理小种（程鸿，我国甜瓜白粉病研究进 展及生理小种的初步鉴定，长江蔬菜，2011 (18) : 1-5)，因此开展针对甜瓜白粉病P. xanthii 2F生理小种的抗病基因研究将是解决甜瓜白粉病的首要突破口。中国专利申请"与甜瓜 白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异性片段及其获得方法"（申请号；200710178022. 7) 中，公开了一种与甜瓜白粉病抗性基因PM-2F紧密连锁的特异片段，其具有序列表中SEQ ID N0:1~4所述的DNA序列；获得的SSR特异片段具有重复性好，标记稳定可靠，便 于统计等优点。2008年，张海英等W高抗白粉病菌P.xanthii 2F的日本网纹甜瓜自交系 K7-1与感病哈密瓜自交系K7-2为亲本构建了包含106个株系的RILs群体，遗传分析发现 K7-1对P. xanthii 2F的抗性由单显性基因Pm-2F控制，筛选得到了与Pm-2F连锁的分子 标记CMBR8(对应于专利申请200710178022. 7中的SSR509)和CMBR120(对应于专利申请 200710178022. 7中的SSR510)，连锁距离分别为1cm和3cm(张海英，甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F的遗传特性及其紧密连锁的特异片段，园艺学报，2008, 35 (12) 1773-1780)。但由于标 记连锁分析所用群体较小、标记与目标基因的遗传距离相对较远等问题，使得该两个标记 应用于甜瓜抗白粉病辅助育种还有一定的局限性。
[0004] 因此，在目前的科研和实践中，开发与Pm-2F更紧密连锁的分子标记，将有助于应 用分子标记辅助选育抗白粉病生理小种P. xanthii 2F的甜瓜品种，同时也为克隆Pm-2F基 因奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记及其获得方 法。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[0007] 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记，具有序列表中的SEQ ID NO: 1~8的至少一个的核巧酸碱基序列。
[000引本发明的目的是通过W下另一技术方案实现的：
[0009] 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，包括如下步 骤：
[0010] 供试材料选取步骤；选取供试材料；
[0011] 甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤：
[0012] 对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗、感池材料；再利用集团混合分析 法，提取所述抗感池材料的基因组DNA，构建抗感DNA池；
[0013] 再通过PCR扩增反应，对黄瓜高密度遗传图谱中的SSR标记进行筛选，获取与目标 性状连锁的SSR标记；
[0014] 再对所述与目标性状连锁的SSR标记进行遗传连锁分析，初步定位目标基因 Pm-2F ；
[0015] 与目标性状连锁的SNP^ndel位点的获取步骤；
[0016] 在所述Pm-2F基因初步定位区间设计引物，在甜瓜抗感亲本与所述抗感DNA池中 进行PCR扩增反应，测序后再经序列比对获取所述与目标性状连锁的SNP^ndel位点；
[0017] 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤：
[001引针对所述与目标性状连锁的SNP^ndel位点分别设计CAI^S^ndel标记，在验证材 料中验证所述候选SNP^ndel位点，获得与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记。
[0019] 进一步地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，所述与目标性状连 锁的SSR标记，具有序列表中SEQ ID NO ;9~14的至少一个的核巧酸碱基序列，其中；
[0020] 序列表中SEQ ID N0:9为引物SSR02733对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序 列；
[0021] 序列表中SEQ ID NO: 10为引物SSR02733对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序 列；
[0022] 序列表中SEQ ID ^:11为引物55302734对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序 列；
[0023] 序列表中SEQ ID NO: 12为引物SSR02734对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序 列。
[0024] 序列表中SEQ ID NO: 13为引物CS27对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0025] 序列表中SEQ ID NO: 14为引物CS27对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列。
[0026] 优选地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，用于PCR扩增所述SSR 标记的引物的核巧酸碱基序列为：
[0027] SSR 引物 SSR02733 ;
[002引 上游引物序列；5' -TTGTTAGGTAAGCCATGCCC-3'，
[0029] 下游引物序列；5' -TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA-3' ；
[0030] SSR 引物 SSR027：M ;
[0031] 上游引物序列；5' -TGTTGTTGGACCCCTTCAAT-3'，
[003引 下游引物序列；5, -TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG-3,；
[0033] SSR 引物 CS27;
[0034] 上游引物序列；5, -GCTGAGTTATGGGGAAAGCA-3,，
[00巧]下游引物序列；5' -ATGTTGTTGGACCCCTTCAA-3，。
[0036] 优选地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，用于所述SSR标记的 PCR扩增反应程序为；
[0037] 阶段 1 ;94°C预变性 3min ;阶段 2 ;94°C 20s，55°C 20s，72°C 30s，共循环 30 次；阶 段3 ;72°C延伸lOmin ;阶段4 ;4°C保持。
[003引进一步地，所述与目标性状连锁的SNP^ndel位点的获取步骤中，所述PCR扩增反 应得到的抗病材料和感病材料特异性扩增的序列，具有序列表中SEQ ID NO: 15~22中至 少一个的核巧酸碱基序列，其中：
[0039] 序列表中SEQ ID NO: 15为引物Cum-1对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0040] 序列表中SEQ ID NO: 16为引物Cum-1对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0041] 序列表中SEQ ID NO: 17为引物Cum-2对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0042] 序列表中SEQ ID NO: 18为引物Cum-2对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0043] 序列表中SEQ ID NO: 19为引物Mel-1对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0044] 序列表中SEQ ID NO: 20为引物Mel-1对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0045] 序列表中SEQ ID NO: 21为引物Cum-3对抗病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列；
[0046] 序列表中SEQ ID NO: 22为引物Cum-3对感病材料特异性扩增的核巧酸碱基序列。
[0047] 优选地，所述与目标性状连锁的SNP^ndel位点的获取步骤中，用于扩增所述抗 病和感病材料特异性扩增的序列的引物的核巧酸碱基序列为：
[0048] Cum-1 引物；
[0049] 上游引物序列；5' -GTACAAGAGTTCTGCTGTGAAGGA-3'，
[0050] 下游引物序列；5' -TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3' ；
[0化^ Cum-2引物；
[0化2]上游引物序列；5' -ATCTTCGAACATCATCTTTGAC-3，，
[0053]下游引物序列；5' -ATCCCAAATCTCCAATATCG-3' ；
[0化4] Mel-1 引物；
[00巧]上游引物序列；5' -CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3'，
[0056]下游引物序列；5' -GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3' ；
[0化7] Cum-3 引物；
[0058] 上游引物序列；5' -CACACAGTGGACAACAGTACAT-3，，
[0059] 下游引物序列；5, -AAGATTGATTGACGATTGATTG-3，。
[0060] 进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中， 用于PCR扩增所述CAI^S标记的引物的核巧酸碱基序列为：
[0061] CAI^S 引物 CAPS-Dde I ;
[0062] 上游引物序列；5' -GCCCAACCTTCAACTCGATA-3'，
[0063] 下游引物序列；5' -TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3' ；
[0064] CAPS 引物 CAPS-Hph I ;
[00化]上游引物序列；5, -CAGTAGGGACACACAACC-3,，
[0066] 下游引物序列；5' -TATGCCATACGCTAATGT-3' ；
[0067] 进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中， 用于所述CAI^S标记的PCR扩增反应程序为：
[0068] 阶段 1 ;94°C预变性3min ;阶段2 ;94°C20s，Tm值20s，72°C30s，共循环30次；阶段 3 ;72°C延伸 lOmin ;阶段 4 ;4°C保持；其中 CAPS 标记 Tm 值为；CAPS-Dde I ;57°C、CAPS-Hph I ：55°C ；
[0069] 进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中， 所述标记CAPS-Dde I的内切酶为Dde I限制性内切酶，所述标记CAPS-Hph I的内切酶为 化h I限制性内切酶；
[0070] 所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，标记 CAPS-Dde I酶切位点为；GCACT，标记CAPS-Hph I酶切位点为；GGTGA ;
[0071] 所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，所述酶切反 应条件为：
[007引阶段1 ;37°C酶切12~16h ;阶段2 ;65°C酶变性20min ;阶段3 ;4°C保持。
[0073] 进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-