6%。 悦5引引物CAPS-Hph I PCR扩增后再利用限制内切酶化h I酶切，120份甜瓜种质资源 材料中，8份材料结果与田间抗病表型不符，其符合率93. 3%。
[0254] 引物IndelOl的PCR扩增中，120份甜瓜种质资源材料中分子标记检测基因型与田 间表型完全吻合。 悦5引引物Indel02的PCR扩增中，120份甜瓜种质资源材料中，3份材料结果与田间抗 病表型不符，其符合率97. 5%。
[0巧6] 上述验证结果进一步证实了所述标记CAPS-Hph I、Indel02、CAPS-Dde I与甜瓜 抗白粉病基因Pm-2F的紧密连锁关系，标记IndelOl与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F呈现共分 离，是基因特异性的分子标记；上述标记可W有效地运用于甜瓜抗白粉病分子辅助育种，在 鉴定甜瓜抗白粉病方面具有较高的利用价值。
[0巧7] 本发明中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。
[025引显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是 对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还 可W做出其他不同形式的变化或变动。该里无法对所有的实施方式予W穷举。凡是属于本 发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 与甜瓜抗白粉病基因 Prn-2F紧密连锁的系列分子标记，其特征在于：所述分子标记 具有序列表中的SEQ ID NO: 1~8的至少一个的核苷酸碱基序列。
2. 权利要求1所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法， 其特征在于：该获取方法包括如下步骤： 供试材料选取步骤：选取供试材料； 甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F的初步定位步骤： 对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗感池材料；再利用集团混合分析法，提 取所述抗感池材料的基因组DNA，构建抗感DNA池； 再通过PCR扩增反应，对黄瓜高密度遗传图谱中的SSR标记进行筛选，获取与目标性状 连锁的SSR标记； 再对所述与目标性状连锁的SSR标记进行遗传连锁分析，初步定位目标基因 Pm-2F ; 与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤： 在所述Pm_2F基因初步定位区间设计引物，在甜瓜抗感亲本与所述抗感DNA池中进行 PCR扩增反应，测序后再经序列比对获取所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点； 与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤： 针对所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点分别设计CAPS/Indel标记，在验证材料中 验证所述候选SNP/Indel位点，获得与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记。
3. 根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记获取方 法，其特征在于： 所述甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F的初步定位步骤中，所述与目标性状连锁的SSR标记，具 有序列表中SEQ ID NO :9~14的至少一个的核苷酸碱基序列，其中： 序列表中SEQ ID N0:9为引物SSR02733对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 10为引物SSR02733对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 11为引物SSR02734对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 12为引物SSR02734对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。 序列表中SEQ ID NO: 13为引物CS27对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 14为引物CS27对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。 优选地，所述甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F的初步定位步骤中，用于PCR扩增所述SSR标记 的引物的核苷酸碱基序列为： SSR 引物 SSR02733 : 上游引物序列：5' -TTGTTAGGTAAGCCATGCCC-3'， 下游引物序列：5' -TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA-3' ； SSR 引物 SSR02734 : 上游引物序列：5' -TGTTGTTGGACCCCTTCAAT-3'， 下游引物序列：5' -TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG-3' ； SSR 引物 CS27 : 上游引物序列：5' -GCTGAGTTATGGGGAAAGCA-3'， 下游引物序列：5' -ATGTTGTTGGACCCCTTCAA-3'。 优选地，所述甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F的初步定位步骤中，用于所述SSR标记的PCR扩 增反应程序为： 阶段 I :94°C预变性 3min ;阶段 2 :94°C 20s，55°C 20s，72°C 30s，共循环 30 次；阶段 3 : 72°C延伸IOmin ;阶段4 :4°C保持。
4. 根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记获取方 法，其特征在于： 所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤中，所述PCR扩增反应得到的抗病 材料和感病材料特异性扩增的序列，具有序列表中SEQ ID NO: 15~22中至少一个的核苷 酸碱基序列，其中： 序列表中SEQ ID NO: 15为引物Cum-I对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 16为引物Cum-I对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 17为引物Cum-2对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 18为引物Cum-2对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 19为引物Mel-I对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO: 20为引物Mel-I对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO:21为引物Cum-3对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列； 序列表中SEQ ID NO:22为引物Cum-3对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。 优选地，所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤中，用于扩增所述抗病和 感病材料特异性扩增的序列的引物的核苷酸碱基序列为： Cum-I引物： 上游引物序列：5' -GTACAAGAGTTCTGCTGTGAAGGA-3'， 下游引物序列：5' -TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3' ； Cum-2引物： 上游引物序列：5' -ATCTTCGAACATCATCTTTGAC-3'， 下游引物序列：5' -ATCCCAAATCTCCAATATCG-3' ； Mel-I引物： 上游引物序列：5' -CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3'， 下游引物序列：5' -GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3' ； Cum-3引物： 上游引物序列：5' -CACACAGTGGACAACAGTACAT-3'， 下游引物序列：5' -AAGATTGATTGACGATTGATTG-3'。
5. 根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取 方法，其特征在于： 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，用于PCR扩增所 述CAPS标记的引物的核苷酸碱基序列为： CAPS 引物 CAPS-Dde I : 上游引物序列：5' -GCCCAACCTTCAACTCGATA-3'， 下游引物序列：5' -TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3' ； CAPS 引物 CAPS-Hph I : 上游引物序列：5' -CAGTAGGGACACACAACC-3'， 下游引物序列：5' -TATGCCATACGCTAATGT-3'。
6. 根据权利要求5所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方 法，其特征在于： 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于所述CAPS标 记的PCR扩增反应程序为： 阶段1:94°0预变性31^11;阶段2:94°0 2〇8，1'111值2〇8,72°0 3〇8，共循环30次；阶段3: 72°C延伸 IOmin ;阶段 4 :4°C保持；其中 CAPS 标记 Tm 值为：CAPS-Dde I :57°C、CAPS-Hph I : 55。。。
7. 根据权利要求6所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方 法，其特征在于： 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm_2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，标记CAPS-Dde I 的内切酶为Dde I限制性内切酶，标记CAPS-Hph I的内切酶为Hph I限制性内切酶； 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，所述标记 CAPS-Dde I酶切位点为：GCACT，所述标记CAPS-Hph I酶切位点为：GGTGA ; 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，所述酶切反应条 件为： 阶段I :37°C酶切12~16h ;阶段2 :65°C酶变性20min ;阶段3 :4°C保持。
8. 根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取方法， 其特征在于： 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于PCR扩增所 述Indel标记引物的核苷酸碱基序列为： Indel 引物 IndelOl : 上游引物序列：5' -GTCCACAGCAATCCAAGCTC-3'， 下游引物序列：5' -CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3'。 Indel 引物 Indel02 : 上游引物序列：5' -GTGTGTGTGTGCAGAAATGGA-3'， 下游引物序列：5 ' -ATGGAACAACCTCCATCTGC-3 '。
9. 根据权利要求8所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方 法，其特征在于： 所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于所述Indel 标记的PCR扩增反应程序为： 阶段1:94°0预变性31^11;阶段2:94°0 2〇8，1'111值2〇8,72°0 3〇8，共循环30次；阶段3: 72°C 延伸 IOmin ;阶段 4 :4°C 保持；其中，分子标记 Tm 值为：Indel01 :58°C，Indel02 :57°C。
10. 根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因 Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取 方法，其特征在于： 所述供试材料选取步骤中，所述供试材料包括： 抗感亲本：父本K7-1，为典型的高抗白粉病菌生理小种P.xanthii 2F的日本类型甜瓜 材料；母本K7-2,为典型的高感白粉病菌生理小种P. xanthii 2F新疆哈密瓜材料； 以所述抗感亲本进行杂交获取的匕代群体； 以所述F1代群体自交获得的F 2代分离群体。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，提供与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法。所述分子标记具有序列表中的SEQ ID NO:1～8的至少一个的核苷酸碱基序列。所述获取方法包括：供试材料选取、甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位、与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取、与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取等步骤，获得与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记。本发明利用上述分子标记进行抗白粉病品种早期筛选鉴定，可以大大缩短育种周期，提高育种效率，具有重要的理论及实践意义。
【IPC分类】C12N15-11, C12N15-10
【公开号】CN104630215
【申请号】CN201510036685
【发明人】许勇, 张春秋, 张海英, 宫国义, 郭绍贵, 任毅
【申请人】北京市农林科学院, 北京京研益农科技发展中心
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月23日