提取基因组dna的试剂盒和提取方法

提取基因组dna的试剂盒和提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学的生物样品提取领域，尤其设及一种提取基因组DNA的试 剂盒和提取方法。
【背景技术】
[000引 目前常采用CTAB法、PTB法、QIAGEN试剂盒法、高盐低抑法等方法提取基因组 DNA。CTAB 法采用 CTAB (hexade巧ltrimeth5dammonium bromide,十六烷基S甲基漠化锭）， 它是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，产生 沉淀，但却不能与核酸形成复合物产生沉淀。通过离屯、获得含有核酸的上清液，通过加入氯 仿等有机试剂进行抽提，去除蛋白、多糖、酪类等杂质后，加入己醇沉淀即可使核酸分离出 来。CTAB法需要用到0-琉基己醇、氯仿、酪等试剂。但酪和氯仿的使用会对人体有一定 的危害，并污染环境。且提取大概需要花费2-3天时间。PTB法需要使用邸TA、蛋白酶K、 PTB、酪、氯仿等试剂，其操作步骤异常繁琐，操作时间需5-7天，操作过程中会使用到酪、氯 仿多种有害物质。高盐低抑法：需要使用邸TA、化C1、醋酸钢、十二烷基硫酸钢（SDS)、氯 仿、醋酸钟等试剂。操作步骤与CTAB法类似，但是提取的DNA得率较低且杂质较多。试剂 盒法；使用方便但是提取的得率较低，在样品本身DNA含量低的情况下具有明显的局限性， 并且成本较高。W上该些提取方法和方法本身的不足在很多文献中有报道。
[0003] 在人们的生产、生活中，木材的保护和合理利用成为人们所关注的焦点。随着时代 发展和人们生活水平的不断提高，木制材料在生活中的应用越来越受到人们的青睐，特别 是一些高档名贵木材制品也挤身于奢侈品行列，成为人们追求生活品质的象征。正是由于 该些珍惜名贵木材与普通木材在价格上存在巨大的差额，导致一些不法分子将一些容易混 淆和不易区分的树种和木材制品当做名贵珍惜树种和木材制品进行销售，极大地扰乱了红 木市场、仿古木市场、古典家具市场和名贵乐器市场的正常秩序，在经济上和精神上给消费 者带来了巨大的损失和打击。而一些禁止砍伐的珍贵树种也被乔装成普通木材进行运输和 走私，该无疑给林业检查和海关人员的识别工作增加了难度。因此，在木材加工、利用、使用 和贸易活动中，对木材进行科学、快速、准确地识别和鉴定就显得尤为重要和迫切。
[0004] 传统的木材识别方法要求鉴定者有丰富的植物学知识和木材构造方面的专业知 识。通常W传统的木材鉴定手段，解剖切片观察木材的构造W及形态特征从而得出判定结 果。由于鉴定者对具体形态特征的主观感受不一样，有时候即使是专业的人员得出的鉴定 结果也不完全一致，尤其是形态特征比较相似的木材品种。随着分子生物学技术的发展，基 因组DNA分析也被运用到鉴定木材的方法中。而运用基因组DNA分析技术识别和鉴定木材 的前提是从木材组织中提取到足够数量和高质量的DNA，W满足后续的PCR扩增、基因测序 等分子生物学鉴定方法。
[0005] 现有的提取方法和试剂盒通常只能用于一般的植物基因组DNA，例如叶片、茎等植 物的幼嫩组织。相比鲜嫩且具有分生能力的植物组织而言，从木材组织中提取和扩增DNA 要困难很多。主要原因为W下几个方面；（1)木材组织中存在的DNA数量较少，且常常降解 成小片段。（2)木材组织中存在有厚壁的管状分子，导致在礙磨处理该些坚硬组织时会产生 高温，该进一步损伤DNA分子。（3)木材中存在一些如蛋白质、酪类、多糖、单宁和色素等物 质，该些物质往往会影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板结合，导致PCR扩增失败。（4) 木材受存放环境地影响，如潮湿环境下会造成木材腐朽和真菌污染，导致DNA降低和污染。 目前还没有针对植物木质部基因组DNA的提取试剂盒和提取方法。在木材交易中，木材的 茎叶往往都已经摘除。成品家具自然更不会有茎叶等幼嫩组织，且通常都经过熏、蒸、挤压 等加工。因此现有植物的DNA提取方法并不适合木材和家具的DNA提取。另一方面，木材 和家具交易是一个快速的交易过程。在木材和家具的进出口过程中，也需要在短时间内完 成木材的鉴定。而现有的植物DNA提取方法通常需要至少2天W上，有的甚至要一周的时 间。因此现有的提取方法不能满足快速鉴定木材基因组DNA的要求。现有的提取试剂和方 法也不能提取出微量样本中DNA，例如采用现有的提取试剂和提取方法提取利用微创方法 采集到的样本中的DNA，其产物得率很差。

【发明内容】

[0006] 为了克服上述现有技术中的问题，本发明提供了提取基因组DNA的试剂盒，包括 试剂1、试剂2和试剂3,其中所述试剂1包括W下组分；〇. 1% -5 %的十六烷基=甲基漠 化锭（质量百分比）、10mM-200mM 的 Tris、10mM-200mM 的邸TA、0. 1% -10% 的 PVP(质量 百分比）、0. 1M-5M的化C1、溶剂为去离子水；试剂2包括W下组分；〇. 1M-6. 5M的盐酸脈、 1% -50%的己醇（体积百分比）、0. 1M-2M的巧樣酸钢、溶剂为去离子水；试剂3包括W下 组分；0. 1M-8M的盐酸脈、0. 05M-0. 2M的甘氨酸、溶剂为去离子水。
[0007] 进一步地，所述试剂盒还包括洗漆液。
[000引进一步地，所述试剂盒还包括洗脱液。
[0009] 进一步地，所述的洗漆液包括去蛋白洗漆液和去离子洗漆液。
[0010] 进一步地，所述去蛋白洗漆液包括1M-6M的盐酸脈，lmM-50mM的邸TA '2化'2肥0， 溶剂为去离子水；所述去盐洗漆液包括20mM-200mM的NaAC ? 3H20,溶剂为去离子水；洗脱 液为去离子水。
[0011] 优选地，所述的试剂包括W下组分；3. 5 %的十六烷基S甲基漠化锭、120mM的 Tris、llOmM的邸TA、6%的PVP、3M的化C1、溶剂为去离子水；试剂2包括W下组分；2. 5M的 盐酸脈、25%的己醇、1M的巧樣酸钢、溶剂为去离子水；试剂3包括W下组分；4M的盐酸脈、 0. 1M的甘氨酸、溶剂为去离子水。
[001引本发明还提供提取基因组DNA的方法，包括W下步骤：
[001引 （1)采样；
[0014] (2)裂解样品细胞：加入65°C预热的试剂1和Proteinase K，祸旋振荡，混合均匀， 65°C水浴0. 5h-过夜；
[0015] (3)沉淀非DNA的杂质；将步骤2中的混合物冷却至室温，加入试剂2,混合均匀， 冰浴；
[0016] (4)离屯、步骤3所得混合物，取上清，加入carrier RNA和试剂3,混合均匀后加入 异丙醇，混匀；
[0017] (5)将步骤4所得混合物中的DNA与纯化载体结合，经过洗漆液的去蛋白洗漆和去 盐洗漆，W及洗脱液的洗脱步骤，获得可用于检测的样本基因组DM ;
[0018] 其中，所述的试剂1包括W下组分；〇. 1% -5%的十六烷基S甲基漠化锭（质量百 分比）、10mM-200mM 的 Tris、10mM-200mM EDTA、0. 1% -10%的 PVP(质量百分比）、0. 1M-5M 的化C1、溶剂为双蒸去离子水；试剂2包括W下组分；〇. 1M-6. 5M的盐酸脈、1% -50%的 己醇（体积百分比）、〇. 1M-2M的巧樣酸钢、溶剂为双蒸去离子水；试剂3包括W下组分： 0. 1M-8M的盐酸脈、0. 05M-0. 2M的甘氨酸、溶剂为双蒸去离子水。
[0019] 进一步地，其中步骤4所述的纯化载体选自核酸提取纯化柱或磁珠。
[0020] 优选地，所述步骤2中65 °C水浴时间为0.化-2h。
[0021] 优选地，在步骤3冰浴时间为lOmin。
[0022] 本发明的有益效果是；本发明所述试剂和方法只需要非常少的样本用量，就能提 取到需要的DNA。例如利用本发明所述试剂和方法，能够提取采样量仅为0.1 g样本中的基 因组DNA。因此本发明可W应用于微创的样品检测方法，对木材样品进行无损伤取样。可 对已加工后的实木成品样品进行提取，例如可用于各种实木家具、实木工艺品、实木古玩等 木材DNA的提取，该即不破坏家具等的材料，又实现了分子生物学层面的物种鉴定工作。在 对珍贵物种中的鉴定中，本发明起到了尤为重要的作用。本发明对传统的CTAB基因组提取 方法的裂解液进行了改良，提高CTAB的浓度的同时，增加了配套试剂，提高了裂解液的裂 解能力W及纯化后DNA的完整性。由于本发明所述试剂1的水浴时间一般为0. 5-化即可 满足DNA提取要求，因此提取时间大大缩短。本发明所用试剂无毒无害，保证操作人员的健 康，避免职业病，对环境无污染，便于运输。加入试剂3试剂可W进一步增加DNA与纯化载 体的结合能力，降低杂质含量、提高产物纯度，提纯效率更高。本发明所述方法操作步骤简 单，能大幅度减少操作时间、可进行规模化操作。
【附图说明】
[0023] 图1是楠木样本提取实验结果。
[0024] 图2是不同样本用量测试实验结果。
[0025] 图3是样本处理时间测试实验结果。
[0026] 图4是加入试剂1后水浴与否，W及加入试剂2后冰浴与否的实验结果。
[0027] 图5是加入Carrier RNA及试剂3的实验结果。
[002引图6是利用本发明提取不同种类木材中的基因组DNA实验结果。
[0029] 图7是经过不同处理方式得到的木材基因的提取实验结果。
[0030] 图8是木材不同部位的基因提取实验结果。
[0031] 图9是不同生长年限木材的基因提取实验结果。
[0032] 图10是木材不同组织部位的基因提取实验结果。
[0033] 图11是试剂选择性实验结果。
[0034] 图12是实施例13的实验结果。
[0035] 图13是实施例14的实验结果。
[0036] 图14是实施例15的实验结果。
【具体实施方式】
[0037] 本发明所述的提取基因组DM的试剂盒包括试剂1、试剂2和试剂3。其中所述试 剂1包括W下组分：
[003引十六烷基S甲基漠化锭0. 1% -5% (质量百分比）
[0039] Tris 10mM-200mM
[0040] 邸 TA 10mM-200mM
[00川 PVP 0. 1%-10% (质量百分比）
[0042] NaCl 0. 1M-5M
[0043] 溶剂为去离子水
[0044] 试剂2包括W下组分：
[0045] 盐酸脈 0. 1M-6. 5M
[0046] 己醇1 % -50 % (体积百分比）
[0047] 巧樣酸钢 0. 1M-2M
[0048] 溶剂为去离子水
[0049] 试剂3包括W下组分：
[0050] 盐酸脈 0. 1M-8M
[005U 甘氨酸 0. 05M-0. 2M
[0化2] 溶剂为去离子水
[005引提取基因组DNA的试剂包括试剂1、试剂2和试剂3,蛋白酶K、Carrier RNA、异丙 醇、洗漆液和洗脱液。
[0054] 在一个实施例中，所述去蛋白洗漆液包括1M-6M的盐酸脈，lmM-50mM的 邸TA ? 2化? 2&0,抑为5. 0-8. 5,溶剂为去离子水。所述去盐洗漆液包括20mM-200mM的 NaAC ? 3&0,抑为3. 5-7. 5,溶剂为去离子水。洗脱液为去离子水。目前市面上可W购买到 的DNA提取用洗漆液和洗脱液也可用于本发明。
[0化5] 在另一个实施例中，试