一种海洋动物标本保存与dna提取一体化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及海洋动物标本保存和DNA提取的方法，特别是海洋动物标本保存与 DNA提取一体化方法。
【背景技术】
[0002] 海洋生物遗传育种、系统发生与多样性评估与保护都离不开分子生物学作为先进 的手段，而最为基础的工作就是组织样品中DNA的获得。标本DNA能否成功提取，跟标本的 保存条件有很大关系。目前常用的海洋动物标本固定主要是用己醇和福尔马林来保存和固 定，但不管用多高浓度的酒精固定，都会导致后期DNA提取得率较低，无法完成一些DNA完 整性较高的研究如DNA文库构建、稀有基因的获得、微卫星开发等。因此，一般DNA质量较 高的试验都是用新鲜样本现场提取DNA，该就对于野外调查和一些不能及时提取DNA的试 验造成了困难，而开发一种可W长期保存，又可W进行DNA提取的方法将具有很大的优势 和应用前景。
[0003] 由于海洋动物长期生活在海洋环境中，形成了有别于陆生动物的一些特殊性组织 结构和成分，最典型的表现为含水量大、无机盐离子成分复杂，含量大、一些种类的多糖含 量高，该导致用常规的动物标本固定和DNA提取非常困难，且长期固定后不易获得高质量 的DNA。陆生动物基因组DNA提取方法中常规的为酪-氯仿法，常用己醇保存动物标本是最 常用且最有效的一种方法，而海洋生物用酒精固定后，经过长期保存用常规的酪-氯仿法 很难提取高质量的DNA，该极大的限制了研究领域，特别是基因组文库的构建，一些稀有基 因的扩增、单拷贝基因、线粒体基因等，很难完成此类研究任务。
[0004] 已有学者对如何提高福尔马林固定鱼类标本DNA提取质量进行了研究，提出了一 些改进的方法，但是尚未有一整套完整的方案能够得到学术界的普遍认同，发表的一些文 献也有一些经过长期固定后得到扩增的事例，但依然对于高质量DNA的获得是一种挑战。 通过对大量甲醒-己醇固定的贝类标本DNA的提取及扩增的尝试，仅有小部分标本能够提 取出DNA，而该小部分的标本DNA中，又只有少数能够进行口S的扩增。原因可能是由于标 本保存时间过长、密封不够完好所致。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种快速、经济、操作简 便的方法，可W采用一体化试剂来完成海洋动物标本固定与DNA提取的过程，获得高质量 DNA，从而提高海洋动物分子生物学的研究效率。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过W下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋 动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特点是，其步骤如下；
[0007] (1)样本固定：
[000引 a.将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织 0. 05-lg分装到2血EP管中；
[0009] b.向标本瓶与/或2血EP管中加入标本固定与DM提取一体化试剂，完全让试剂 浸没动物组织，动物组织与试剂的质量体积比为Ig ;1. 2血；所述的试剂配方为：
[0010] pH = 8. 0 的 lOmmol/L Tris. C1，抑=8. 0 的0.1 mmol/L EDTA，0. 5% SDS，Protease K 0.33g/L ;
[0011] (2)样本保存；样本保存条件温度为-80°C -35°C ;
[0012] (3) DM提取；将标本瓶中的组织样本取0. 05-lg移入2血EP管，并吸取原标本瓶 中的固定液0. 6111以或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55°C下消化1-化，W消解液 透明为准，然后按照常规的酪一氯仿法提取DNA;当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解 而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋祸后取固定液0. 6mL直接在55°C下消化 1-化，W消解液透明为准，然后按照常规的酪一氯仿法提取DNA。
[0013] 本发明所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法的步骤（1)中；所述 的海洋动物优选自鱼类、邮类、蟹类、贝类、腔肠动物，也可W为其它的海洋动物。在步骤（2) 中；样本保存条件温度优选为-2〇°C至35°C。在-20°C至35°C可保存至少7个月W上，不影 响DNA的提取效率。
[0014] W下对发明人所作的研究试验进行阐述。
[001引一、试验过程
[0016] (1)取连云港海产海洋生物中，学界认为因多糖含量高、容易降解、最难提取DNA 的贝类中的青始为代表，100个体分成5组，20°C、35°C、4°C和-20°c该4个保存温度为试验 组，W只在W 75%酒精固定后的20°C保存样本为对照组。样本大小为2龄始随机样本。
[0017] 似配制标本固定与DNA提取一体化试剂1L，青始配方为；lOmmol/L Tris. C1 (pH =8. 0)，0.1 mmol/L 邸TA(pH = 8. 0)，0. 5% SDS，Protease K 0. 33g/L。
[0018] (3)活体处死去壳后用超纯水清洗肌肉，吸水纸吸干后取肌肉约Ig，加入1. 2ml组 织固定与DNA提取一体化试剂。每组固定30支，长期放在各自恒温箱内，其中4°C和-20°C 在冰箱冷藏和冷冻温度，20°C和35°C为恒温培养箱内完成。
[0019] (4)每个月每组取3-8支进行DNA的提取，W评价贝类肌肉组织固定和保存后DNA 的提取效果。试验持续时间为2012年7月1日-2013年1月30日，每月30日取样，提取 DNA。
[0020] 巧)DNA提取；将加过固定液的组织样本取0. 05g，移入2ml EP管，并吸取原标本 瓶中的固定液0. 6ml，在55°C水浴摇床下消化1-化（消化时间W固定液变透明为准），然 后按照常规的酪一氯仿法提取DNA。部分固定的样本组织溶解，特别是在35°C下保存的样 本，无法取得固定组织，直接将原标本瓶固定液旋祸后取固定液0. 6ml直接在55°C下消化 1-化（消化时间W固定液变透明为准），然后按照常规的酪一氯仿法提取DNA，具体为裂解 完毕后每只离屯、管加入600 y 1 Tris饱和酪，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10~ 15min，1200化pm，4°C离屯、lOmin，取上清液，加入600 y 1氯仿异戊醇混合液，轻轻振荡摇 匀，颠倒45-55次，室温静置10~15min，12000巧m，离屯、lOmin，取上清液，加入1200 y 1冷 冻无水己醇，颠倒45-55次，室温静置10~15min，8000巧m，离屯、lOmin，弃上清，即得DNA， 在离屯、管中加入1500 y 1 70 %的己醇，洗漆两次，然后8000巧m，离屯、8min，弃上清，室温风 干，直至己醇挥发完毕，加入50 y 1TE，溶解DNA，4°C保存，制备0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测。 [002U 做提取的DM电泳检测：图1为经过固定7个月的保存后提取DM的电泳检测 效果由图可知，酒精固定后的样本经过7个月出现了降解，拖尾现象明显，DM提取的得率 较低，而其余温度下每组均获得了高质量的DNA，证明了该种固定和提取一体化方法是成功 的。
[002引 （7)提取的DNA PCR验证检测
[0023] 利用GenBank中青始的微卫星标记QG9-157 (登录号JQ768829)进行PCR验证。
[0024] 引物序列 F:GTCCTGTCCCAATAAACG ;R:
[00巧]TAGCATTCCTTCGCATAA，反应条件；
[0026] 15 y 1 体系；
[0027]
【主权项】
1. 一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特征在于，其步骤如下： (1) 样本固定： 将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0. 05-lg分 装到2mL EP管中； 向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂，完全让试剂浸没动 物组织，动物组织与试剂的质量体积比为I g :1. 2 mL ;所述的试剂配方为： pH=8. 0 的 lOmmol/L Tris. Cl，pH=8. 0 的 0· lmmol/L EDTA，0. 5% SDS， Protease K 0.33g/L ； (2) 样本保存：样本保存条件温度为-80°C -35°C ; (3) DNA提取：将标本瓶中的组织样本取0. 05-lg移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中 的固定液〇. 6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55°C下消化l_4h，以消解液 透明为准，然后按照常规的酚一氯仿法提取DNA ;当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解 而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0. 6mL直接在55°C下消化 l_4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚一氯仿法提取DNA。
2. 根据权利要求1所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特征在于， 步骤（1)中：所述的海洋动物选自鱼类、虾类、蟹类、贝类、腔肠动物。
3. 根据权利要求1所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特征在于， 步骤（2)中：样本保存条件温度为-20°C至35°C。
【专利摘要】本发明是一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下：将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0.05-1g分装到2mL EP管中；向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂；将标本瓶中的组织样本取0.05-1g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。本发明方法设计合理，操作方便，可以实现海洋动物标本保存与DNA提取一体化操作。
【IPC分类】A01N1-00, C12N15-10
【公开号】CN104630207
【申请号】CN201510072067
【发明人】李晓英, 陈百尧, 张庆起, 赵帅, 伏光辉, 安健, 董志国, 阎斌伦
【申请人】淮海工学院, 连云港赣榆佳信水产开发有限公司, 连云港市海洋与水产科学研究所, 连云港帅森海水养殖专业合作社
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月11日