一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种增强DNA聚合酶D化持续合成DNA能力的方法，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] Y-家族DNA聚合酶D化是一类跨损伤合成聚合酶（TLS)，它能够代替复制性DNA 聚合酶跨越模板损伤处使得DNA合成继续，从而帮助细胞抵抗DNA损害。但为了防止出现 更多突变，跨越损伤后化h会被立即切除，正常的复制性聚合酶会恢复对DNA合成的控制， 该就说明D化与DNA的结合是短暂的。D化的结构是典型的右手结构，分为拇指（thumb)、 手掌（palm)、手指的nger)、小手指（little-finger)四个结构域，相比其它DM聚合酶， D化的手指域很小，导致与新生碱基对的大沟几乎没有接触，另外它的拇指域短而粗，使得 D化与DNA及渗入核巧具有较少的作用，总的来说，D化对其DNA底物施加的约束很少。它 的结构特点和功能要求决定了 D化有着较低的持续合成能力。结构的特异性表明，提高聚 合酶对DNA底物的亲和力是提高Y-家族聚合酶持续合成能力的有效途径。
[0003] 复制性DNA聚合酶大多通过与被称为"DNA滑动夹"的环形蛋白质相互作用实现其 较高的持续合成能力，该种环形蛋白质能环绕DNA将聚合酶催化单元连接到DNA上，根据该 一认识，曾对Y-家族聚合酶进行过相应改造，将硫化叶菌DNA聚合酶IV值po4)与真核细胞 的增殖细胞核抗原（PCNA)亚基1和2组成复合物，将D化与PCNA亚基1组成复合物。最 终结果表明，Dpo4和D化都表现出持续合成能力的相应提高，然而，环绕DNA模板的环形滑 动夹由个于存在空间位阻，在某种程度上阻止聚合酶与引物-模板接合点的结合，所W提 高的持续合成能力也是极其有限的。
[0004] 本发明通过融合Sso7d来提高化h的持续合成能力。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的问题是提供一种增强DNA聚合酶D化持续合成DNA能力的方法， 利用柔性linker在Y-家族聚合酶D化的N末端连接蛋白Sso7d来增强D化对聚合底物的 亲和力，从而提高化h持续合成能力。该方法还可W用来提高Y家族其他DNA聚合酶的持 续合成DNA的能力。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，编码所述DNA聚合酶化h的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，编码所述Sso7d蛋白的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[000引在本发明的一种实施方式中，编码所述N末端连接了 Sso7d的化h的核巧酸序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，编码所述柔性linker的核巧酸序列如SEQ ID NO. 4 所示。
[0010] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶 化h，是在其N端通过柔性linker连接了蛋白Sso7d。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，编码所述DM聚合酶化h的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，编码所述Sso7d蛋白的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，编码所述N末端连接了 Sso7d的化h的核巧酸序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，编码所述柔性linker的核巧酸序列如SEQ ID NO. 4 所示。
[0015] 本发明还提供一种获得所述持续合成DM能力增强的DM聚合酶化h的方法，主 要包括W下步骤：合成编码DNA聚合酶D化的核巧酸序列，并在C末端附加6个组氨酸作为 标签；合成编码Sso7d的核巧酸序列，W柔性linker将Sso7d连接到D化的N末端，W载体 PSV2-DHFR携带编码连接了 Sso7d的化h的基因，转化大肠杆菌进行表达，分离纯化得到连 接了 Sso7d 的 Dbh。
[0016] 本发明成功表达、纯化了 Sso7d融合的Y-家族DM聚合酶化h，即S化h，W及天然 的化h，聚合酶活性、持续合成能力评价和稳态动力学分析的结果表明，S化h对DNA底物的 亲和力、DNA持续合成能力均增强了。本发明改造后的化h W及携带该酶的试剂盒将对基 因工程的操作产生重要积极作用。
【附图说明】
[0017] 图1D化和Sso7d及DNA复合物的带状图。
[00化]图2纯化各阶段咖1和S化h等分试样的纯化；1 ;Marker，2 ;含有S化h的整个细 胞提取物，3 ;含S化h可溶细胞提取物78°C加热12min后的上清，4 ;结合了 S化h的Ni柱清 洗缓冲液，5 ;Superdex 75凝胶过滤和Monos色谱后的S化h成分，6 ;Superdex 75凝胶过滤 和Monos色谱后的化h成分，7 ;结合了化h的Ni柱清洗缓冲液，8 ;含D化可溶细胞提取物 78°C加热12min后的上清，9 ;含有化h的整个细胞提取物。
[0019] 图3D化和S化h持续合成能力。
【具体实施方式】
[0020] W下是S化h和D化蛋白表达纯化及相关聚合酶活性、持续合成能力评价和稳态动 力学分析的具体实施例。
[0021] 实施例1 D化和S化h基因的克隆
[002引通过IDT公司合成D化基因序列（SEQ ID NO. 1)，并在其C末端附加6个组氨酸作 为标签，目标基因利用引物F化h和化Ibh进行PCR扩增，包含有T7启动子、核糖结合位点、 T7终止子W及氨节抗性的PSV2-畑FR载体作为目标基因的高拷贝克隆载体，利用T4DNA连 接酶将D化基因克隆在质粒PSV2-DHFR的Ndel和BamHI位点的重组载体DHFR-化h ;重组 后的DHFR-化h基因被转化进入感受态细胞并进行DNA测序验证。
[0023] 根据发布的Sso7d氨基酸序列合成其基因序列，根据Gibson Assembly方法利 用柔性linker (SEQ ID NO. 4)将Sso7d (SEQ ID NO. 2)连接到Dbh的N末端，利用引物 Fdp〇-linker、Rdp〇-化fr、Fss〇-化fr、Rss〇-linker 进行 PCR扩增从而将 Dbh、linker、Sso7d S个片段的基因组合在一起，组合的基因片段被Ndel和BamHI限制酶处理使其线性化，提 取完整的重组质粒DHFR-S化h并用DNA测序进行验证。
[0024] 表1.引物序列
[0025]
【主权项】
1. 一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法，其特征在于，利用柔性linker 在Dbh的N末端连接蛋白Sso7d。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，编码所述Sso7d蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种增强Y家族DNA聚合酶持续合成DNA能力的方法，其特征在于，利用柔性I inker 在Dbh的N末端连接蛋白Sso7d。
4. 一种持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，其N端通过柔性linker 连接了蛋白Sso7d。
5. 根据权利要求4所述的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，编码所述Ss〇7d蛋白的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。
6. 根据权利要求4所述的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，编码所述柔性linker的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
7. -种获得权利要求4所述持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶Dbh的方法，其特征 在于，主要包括以下步骤：合成编码DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列，并在C末端附加 6个组 氨酸作为标签；合成编码Sso7d的核苷酸序列，以柔性linker将Sso7d连接到Dbh的N末 端，以载体PSV2-DHFR携带编码连接了 Ss〇7d的Dbh的基因，转化大肠杆菌进行表达，分离 纯化得到连接了 Sso7d的Dbh0
8. 含有权利要求4所述DNA聚合酶Dbh的载体或重组细胞。
9. 含有权利要求4所述DNA聚合酶Dbh的试剂盒。
10. 权利要求4所述DNA聚合酶Dbh在DNA复制中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法，属于酶工程领域。本发明利用柔性linker在Y-家族聚合酶Dbh的N末端连接Sso7d组合成Sdbh蛋白来增强Dbh对聚合底物的亲和力，提高Dbh持续性合成能力。发明首先对Y家族DNA聚合酶Dbh基因进行克隆并构建Sso7d-dbh融合蛋白，然后通过E.coli BL21菌株表达Dbh和Sdbh，并对纯化的Dbh和Sdbh进行聚合酶活性、持续合成能力评价及稳态动力学分析一系列的对比实验，最终证实Sso7d能够提高Dbh的持续合成能力。
【IPC分类】C12N15-10, C12N15-63, C12N9-12
【公开号】CN104630205
【申请号】CN201510038532
【发明人】吴静, 王立
【申请人】江南大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月26日