一种快速、高通量提取植物基因组dna的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、高通量提取适用于PCR扩 增的植物基因组DNA的提取方法，并进一步公开其应用。
【背景技术】
[0002] 基因组DNA作为遗传信息的载体和最基本的遗传物质，在遗传变异、代谢调控等 方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程的主要研究对象。植物基因组DNA被用来作 为PCR反应的模板进行基因克隆、定位、分子标记辅助育种、转基因材料检测等研究。无论 是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从 植物组织中提取天然状态的高分子量的DNA。因此，提取出足够量的高质量的DNA是获得准 确实验结果的前提和必要保障。
[0003] 植物基因组DNA提取的方法有很多，基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、 Southern杂交（包括RFLP)及PCR分离基因等。不同植物的基因组DNA提取方法有所不 同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及成分不同，分离方法也有差异。
[0004] 常用的植物基因组提取方法主要包括SDS法和CTAB法两种，但植物细胞内不仅具 有很高的核酸酶活性，而且其细胞壁含有大量的多糖，且其组成因物种不同而各异。这些多 糖对植物基因组DNA的提取过程中的共沉淀步骤造成了影响，降低了核酸的纯度。使得这 两种传统方法提取过程繁琐、耗时耗力，冗长的提取过程不仅增加了基因组DNA被污染的 可能，影响了其纯度，还可能降低了活性，丧失其天然特性；同时由于频繁的使用多种有毒 有害的有机溶剂，产生大量的有毒废液，因此已被大多数实验室摒弃。
[0005] 随之兴起的试剂盒法是根据核酸分子量的差异或利用特异性膜对DNA的特异性 吸附而实现对DNA的分离，它的出现在一定程度上减轻了科研人员的负担，适用于少量高 纯度植物基因组DNA的提取，但其操作过程也过于繁琐，且价格昂贵，不适用于群体遗传 学、分子标记辅助育种、转基因植株筛选等需要大规模基因组提取的实验。因此，迄今为止， 还没有形成快速、简便的植物基因组DNA提取的技术方法。
[0006] 中国专利CN102839167A公开了一种简易快速高通量提取植物基因组DNA的方法， 该方法通过优化DNA提取液的配方，利用三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl(pH8.0)、 乙二胺四乙酸（EDTA)和氯化钾的自配试剂配方，在不使用酶试剂且无需液氮研磨的情况 下完成DNA组的提取，不仅操作简单且成本低。一次可以高通量处理384个样品，且提取过 程仅需2. 5小时，耗时短。所提DNA仅需0. 5微升为PCR模板，纯度高且清洁无污染。该方 法可广泛应用于植物群体遗传学、系统进化、分子标记辅助育种和深度测序等研究，适于产 业化生产和普通生物实验室科学研究。但是，其提取过程依然较为繁琐，也依然存在提取时 间较长的技术问题。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于现有技术中提取植物基因组DNA的方法提取过 程繁琐、耗时耗力的技术问题，进而提供一种可快速、高通量提取适用于PCR扩增的植物基 因组DNA的提取方法，并进一步公开其应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所述的快速、高通量提取植物基因组DNA的方法，包 括如下步骤：
[0009] (1)取待提取的植物组织加入SDS提取液混匀，并充分研磨；所述SDS提取液配方 为：80-120mMTris?HCl，40-60mMEDTA，80-120mMNaCl，0. 5-1. 5%w/vSDS，pH8. 0 ;
[0010] (2)将研磨后的样品于60-70°C加热5~lOmin，并于室温下高速离心处理；随后 吸取样品上清液，并加入等体积的异丙醇混匀，室温下静置处理；
[0011] (3)将静置处理后的样品再次高速离心处理，并除去上清液，随后加入质量浓度不 低于70 %的乙醇，充分混匀；
[0012] (4)将混合后的样品再次高速离心处理，完全弃去上清液后，将所述样品干燥处 理；
[0013] (5)向干燥后的样品中加入双蒸水，于35_40°C温度下静置，并常规保存，即得所 需的植物基因组DNA作为模板进行后续的PCR反应。
[0014] 优选的，所述步骤（1)中，所述SDS提取液配方为：100mMTris?HCl，50mMEDTA， IOOmMNaCl，1%w/vSDS，pH8. 0。
[0015] 所述步骤⑴中，所述植物组织的质量与所述SDS提取液的体积比为 1 : 0.2-0. 5,其中，所述质量与体积的比例单位为g/mL。
[0016] 优选的，所述植物组织的质量与所述SDS提取液的体积比为1 : 0.3。
[0017] 所述步骤（2)、⑶和⑷中，所述高速离心步骤的转速彼此独立的为 10000_12000rpm，并离心处理 8_15min。
[0018] 所述步骤（1)中，所述植物组织包括植物的幼苗、子叶、真叶、嫩茎或嫩根部位组 织。
[0019] 所述植物包括棉花、油菜、水稻、玉米、小麦或者大豆。
[0020] 所述步骤（1)中，所述研磨步骤是利用高通量组织研磨仪进行研磨。
[0021] 所述步骤（4)中，所述干燥步骤为真空干燥。
[0022] 所述步骤⑷中，所述干燥温度为50-70 °C。
[0023] 本发明所述的快速、高通量提取植物基因组DNA的方法通过SDS提取液的精心配 比，降低了部分试剂的使用量（SDS的浓度由常规的2%降至l%，NaCl的浓度由常规提取液 中的500mM降至IOOmM)，不仅所需试剂少，而且无需使用昂贵的酶及其它生化试剂（现有技 术中其它提取方法还需使用CTAB，巯基乙醇等）。这样使得本发明所述提取DNA的方法不仅 成本低廉，平均每个样品成本〇. 2~0. 5元（其它常规方法需要1~9元）；而且整个方法 操作较为简单，仅需5步即可完成（其它常规方法需要10~20步）；最重要的是，所述DNA 的提取通量高、所需时间短，一次性操作192个样品整个实验过程约需Ih~I. 5h(其它常 规方法约需3~6h)。同时本发明所述方法可适用于多种植物（棉花、油菜、水稻、玉米、小 麦、大豆等），相较于其他常规方法适用性更高，所得基因组DNA可广泛应用于群体遗传学、 分子标记辅助育种、转基因植株筛选等需要大规模基因组提取的实验。
【附图说明】
[0024] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
[0025] 图1为利用本发明各样品和全式金植物基因组提取试剂盒提取的植物基因组DNA 电泳图谱；其中，序号1-6分别为利用本发明提取的棉花、玉米、油菜、水稻、大豆、小麦基因 组DNA电泳图谱，1' -6'分别为利用全式金植物基因组提取试剂盒提取的棉花、玉米、油菜、 水稻、大豆、小麦基因组DNA电泳图谱；
[0026]图2为以本发明提取的各样品植物基因组为模板，扩增各植物内标准基因的电泳 图谱。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1
[0028] 剪取新鲜玉米叶片约lg，叶片可直接用于基因组提取，也可在4°C保存备用，10天 内提取。将叶片和一粒直径约3mm的钢珠放入I. 5ml离心管中，加入300yL改良的SDS提 取液。所述SDS提取液配方为：100mMTris*HCl，50mMEDTA，100mMNaCl，l%w/vSDS， pH8. 0〇
[0029] 将离心管移至高通量组织研磨仪磨样器中，设置频率为33次/秒，震荡30s，将研 磨后的样品放入65°C加热5~lOmin，期间3~4次颠倒混匀。将加热后的离心管放入离 心机，在12000rpm条件下，室温离心lOmin。于每管中吸取100yL上清液，放入96孔板中， 用排枪加入等体积的异丙醇，每板盖上硅胶垫，上下颠倒混匀，室温静置30min。
[0030] 将静置后的样品于12000rpm条件下再次离心lOmin，将硅胶垫打开，甩净上清，再 用排枪往96孔板中加入200yL质量浓度为70%的乙醇，上下颠倒96孔板，并轻弹管壁。
[0031] 将所述样品再次于12000rpm条件下离心lOmin，将硅胶垫打开，甩净上清。将96 孔板倒置于干净的吸水纸上lmin，然后将96孔板正面朝上放置在真空干燥仪中60°C干燥 2min〇
[0032] 在所述96孔板的每孔中加入40yL双蒸水，37 °C放置Ih后放入4°C冰箱常规保存 备用或-20°C常规冻存备用，作为模板进行后续的PCR反应。
[0033] 基因组提取以全式金植物基因组提取试剂盒作为对照。取1~2yL作为模板，扩 增玉米内标准基因zSSIIb(引物和反应条件按农业部869号公告-3-2007执行）。
[0034] 实施例2
[0035] 剪取新鲜大豆叶片约lg，叶片可直接用于基因组提取，也可在4°C保存备用，10天 内提取。将叶片和一粒直径约3mm的钢珠放入I. 5ml离心管中，加入200yL改良的SDS提 取液。所述SDS提取液配方为