一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组dna的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的分子生物学方法。
【背景技术】
[0002]昆虫的基因组DNA对于昆虫的分类鉴定、系统进化、物种多样性等方面的研宄具有重要意义，高质量的DNA是进行相关研宄的前提。传统的昆虫基因组DNA提取方法需要先将虫体破碎研磨，再经过蛋白酶消化和有机溶剂抽提，最终得到基因组DNA。这些方法会对昆虫样本造成永久性的破坏，不利于保留样本的完整性，尤其是一些珍稀的昆虫样本，进而对后续的形态学分类鉴定产生一定的影响。同时，传统的提取方法需要用到苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂，这些溶剂都具有一定的毒性，会对操作人员和周围环境产生潜在的危害。
[0003]侯晓晖等公开的“一种提取昆虫DNA的方法”(申请号201310210257.5)中提出了一种在不破坏虫体的情况下提取昆虫基因组DNA的方法。其主要步骤是将昆虫浸入STE缓冲液中，按照10%的比例加入蛋白酶K，56°C孵育I h以上，然后取出虫体，余下的溶液中即含有昆虫的基因组DNA，该方法主要是利用蛋白酶K的消化作用使DNA释放至缓冲液中。然而该方法尚存在一些不足之处:(I)仅通过蛋白酶K的消化作用不足以充分释放出昆虫体内的DNA，尤其是一些体表被几丁质外壳包裹的昆虫；(2)蛋白酶K消化后，没有经过高温使蛋白酶失活，残留的酶会对后续实验产生一定的影响；(3) 56°C长时间孵育会使基因组DNA发生降解，影响DNA质量。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有方法的缺陷与不足，提供了一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，包括以下具体步骤:
I提取缓冲液的配制
配制基因组DNA提取缓冲液:10XPCR Buffer II，0.45% ΝΡ40，0.45% Tween20，0.6 mg/mL蛋白酶K，ddH20补至最终体积。
[0006]2虫体的预处理
先用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗2?4遍，最后用吸水纸吸干虫体表面水分。
[0007]3基因组DNA的提取
(1)将昆虫放入离心管内，加入3?6倍虫体体积的提取缓冲液，50±5°C水浴I?2h，每隔10?20 min轻柔颠倒混匀一次；
(2)_20°C放置14?17 h，冷抽提基因组DNA ；
(3)加入蛋白酶K，使其终浓度为0.6 mg/mL，50±5°C水浴I?2 h，每隔10?20 min轻柔颠倒混匀一次；
(4)95°C水浴10?15min，灭活蛋白酶K;
(5)用无菌镊子将昆虫从离心管中取出，放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有该昆虫的基因组DNA，-20 °C保存备用。
[0008]4基因组DNA的鉴定
(1)通过1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量；
(2)以基因组DNA为模板，通过PCR扩增线粒体COl基因来检测基因组DNA是否满足后续的生物学实验要求。
[0009]本发明与现有方法相比具有以下优点:(1)提取过程无需使用有毒的有机溶剂，减少了对操作者和环境的危害；(2)提取缓冲液中除了加有蛋白酶K之外，还加有温和的表面活性剂NP40和Tween20，既增强了对昆虫的消化能力，增加了 DNA的释放量，又不会对昆虫形态产生破坏；(3)-20°C低温冷抽提DNA不仅减少了 DNA的降解，还提高了得率；(4)最后经过95°C高温灭活蛋白酶K，消除了其对后续实验的影响。
【附图说明】
[0010]图1是样品I和2的基因组DNA电泳检测结果；
其中:1:样品I的基因组DNA，2:样品2的基因组DNA，M: Transit DNA分子量标准。
[0011]图2是分别以样品I和2的基因组DNA为模板，PCR扩增COl基因的电泳检测结果;
其中:1:样品I的PCR结果，2:样品2的PCR结果，M: TransTk DNA分子量标准。
[0012]图3是样品I的基因组DNA提取如后，昆虫外形的对比；
图4是样品2的基因组DNA提取前后，昆虫外形的对比。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图和具体实例对本发明做进一步的详细说明，本发明并不局限于以下实施例。
[0014]实施例1
提取膜翅目蚂蚁(样品I)的基因组DNA。
[0015]I提取缓冲液的配制
配制 400 UL 提取缓冲液:40 μ L 10XPCR Buffer 11,1.8 μ L ΝΡ40,1.8 μ LTween20，12 μ L 蛋白酶 K (20 mg/mL)，344.4 ULddH2O0
[0016]2虫体的预处理
先用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗3遍，最后用吸水纸吸干虫体表面水分。
[0017]3基因组DNA的提取
(1)将蚂蚁放入离心管内，加入3004 1^提取缓冲液，50°0水浴1 h，每隔15 min轻柔颠倒混匀一次；
(2)_20°C放置15 h，冷抽提基因组DNA ；
(3)加入9UL蛋白酶K (20 mg/mL)，50°C水浴I h，每隔15 min轻柔颠倒混勾一次； (4)95°C水浴10min，灭活蛋白酶K;
(5)用无菌镊子将蚂蚁从离心管中取出，放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有蚂蚁的基因组DNA，-20°C保存备用。
[0018]4基因组DNA的鉴定
1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量，如图1中泳道I所示，样品I的基因组DNA条带单一，没有出现弥散，说明基因组DNA的完整性很好，没有产生降解。
[0019]如图2中泳道I所示，以样品I的基因组DNA为模板，PCR扩增出来的COl基因条带十分清晰特异，表明基因组DNA能够满足后续的生物学实验要求。
[0020]5 DNA提取前后蚂蚁外形的对比
如图3所示，提取基因组DNA前后，样品I的外形没有发生明显变化，说明整个提取过程没有对虫体形态产生破坏。
[0021]实施例2
提取同翅目叶蝉(样品2)的基因组DNA。
[0022]I提取缓冲液的配制
配制 300 UL 提取缓冲液:30 μ L 10XPCR Buffer 11,1.35 μ L ΝΡ40,1.35 μ LTween20，9 μ L 蛋白酶 K (20 mg/mL)，258.3 ULddH2O0
[0023]2虫体的预处理(同实施例1)
3基因组DNA的提取
(1)将叶蝉放入离心管内，加入2004 1^提取缓冲液，50°0水浴1 h，每隔15 min轻柔颠倒混匀一次；
(2)_20°C放置15 h，冷抽提基因组DNA ；
(3)加入6UL蛋白酶K (20 mg/mL)，50°C水浴I h，每隔15 min轻柔颠倒混勾一次；
(4)95°C水浴10min，灭活蛋白酶K;
(5)用无菌镊子将叶蝉从离心管中取出，放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有叶蝉的基因组DNA，-20°C保存备用。
[0024]4基因组DNA的鉴定
如图1中泳道2所示，样品2的基因组DNA条带单一，没有出现弥散，说明基因组DNA的完整性很好，没有产生降解。
[0025]如图2中泳道2所示，以样品2的基因组DNA为模板，PCR扩增出来的COl基因条带十分清晰特异，表明基因组DNA能够满足后续的生物学实验要求。
[0026]5 DNA提取前后叶蝉外形的对比
如图4所示，提取基因组DNA前后，样品2的外形没有发生明显变化，说明整个提取过程没有对虫体形态产生破坏。
【主权项】
1.一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，其特征在于:包括以下具体步骤: (1)配制基因组DNA提取缓冲液； (2)用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗2?4遍，吸水纸吸干虫体表面水分； (3)将昆虫放入离心管内，加入3?6倍虫体体积的提取缓冲液，50±5°C水浴I?2h，每隔10?20 min轻柔颠倒混匀一次； (4)_20°C放置14?17 h，冷抽提基因组DNA ； (5)加入蛋白酶K，使其终浓度为0.6 mg/mL，50±5°C水浴I?2 h，每隔10?20 min轻柔颠倒混匀一次； (6)95°C水浴10?15 min，灭活蛋白酶K ; (7)用无菌镊子将昆虫从离心管中取出，放入95%酒精中存留，离心管内的溶液即含有该昆虫的基因组DNA，-20 °C保存备用。
2.根据权利要求1所述的无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，其特征在于:所述提取缓冲液配制如下:10XPCR Buffer II,0.45% ΝΡ40，0.45% Tween20，0.6 mg/mL 蛋白酶K，ddH20补至最终体积。
3.根据权利要求1所述的无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，其特征在于:步骤(7)所得到的基因组DNA质量可以通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。
【专利摘要】一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，包括以下几个步骤：1）配制基因组DNA提取缓冲液；2）用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗；3）将昆虫放入离心管内，加入3～6倍虫体体积的提取缓冲液，50±5℃水浴； 4）-20℃放置14～17 h，冷抽提基因组DNA；5）加入蛋白酶K，使其终浓度为0.6 mg/mL，50±5℃水浴；6）95℃水浴灭活蛋白酶K；7）将昆虫从离心管中取出，管内溶液即含有该昆虫的基因组DNA。该提取方法不仅能够保持虫体的完整性，而且经过-20℃冷抽提，使昆虫的基因组DNA在低温条件下从虫体内充分释放，避免了基因组DNA的降解，提高了基因组DNA的质量。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104630209
【申请号】CN201510114907
【发明人】魏攀, 李锋, 罗朝鹏, 王燃, 魏春阳, 王中, 武明珠, 张剑锋, 金立锋, 杨军, 林福呈
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年3月17日