一种Small RNA cDNA文库的构建方法
【技术领域】
[000。 本发明涉及一种Small RNA cDNA文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 生物技术和生命科学将成为21世纪引发新科技革命的重要推动力量，包括我国 在内的诸多国家已将其列入优先发展的重点研究领域，而基因测序技术作为生物产业发展 的核也共性技术，已成为各发达国家竞相抢占的科技制高点，而相关的技术均被少数几家 欧美公司所垄断且设备价格昂贵。
[0003] 基因测序要用基因测序仪和测序试剂，而基因测序仪和试剂盒的生产因为涉及有 机化学合成，基因改造，催化酶合成和测序等多方面的技术，工艺复杂，质量要求高，目前主 要只有H个美国生产厂家，而一台仪器一年的试剂费用达1000多万元。因为消耗高，我国 很多高价购置的测序仪都处于闲置和痛疾状态。
[0004] 基因测序工作仍然与我们密切相关，因为蛋白质组仅能告诉我们疾病的分子症 状，而基因才是引发疾病的根本原因。若要进行疾病预测，疾病敏感基因的鉴定就必不可 少。只有综合运用遗传学，蛋白组学，转录组学和代谢组学才能推动个体化医疗前进。
[0005] 高通量测序技术，是近几年出现的一项革命性测序技术，利用其高通量高覆盖度 的优势，可W在极短的时间内获取数百万甚至数十亿的序列数据信息。目前在基础科学研 究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。
[0006] 科学往往是在技术的竞争中发展进步的，高通量测序技术的发展亦是如此，随着 第H代测序技术的发展，个体化医疗等诸多生命科学与医学问题的解决很大程度上依巧 测序技术的发展，应用前景非常广阔，市场非常巨大。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种 Small RNA (microRNAs、siRNAs 和 piRNAs) cDNA 文库 的构建方法。
[0008] 本发明提供的一组DM分子，该组分子由如下（1)- (4)所示的四种分子组成：
[0009] (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子；
[0010] (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子；
[0011] (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子；
[001 引（4) SEQ ID No. 4 所示的 DNA 分子。
[0013] 一组3'接头分子也属于本发明的保护范围，该组分子是将上述DNA分子的5'末 端连接一个rApp，3'末端连接一个封闭基团制成；
[0014] 所述封闭基团具体为氨基、2'，3' -双脱氧胞嚼巧核巧或3'倒置的脱氧腺嘿岭核 巧。
[0015] 一组反转录引物也属于本发明的保护范围，该组引物由如下（1)- (4)所示的四种 分子组成：
[0016] (1) SEQ ID No. 5 所示的 DM 分子；
[0017] (2) SEQ ID No. 6 所示的 DM 分子；
[0018] (3) SEQ ID No. 7 所示的 DM 分子；
[0019] (4) SEQ ID No. 8 所示的 DM 分子。
[0020] 5'接头分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID No. 9所示。
[0021] 上述5'接头分子中，所述分子的碱基全部进行2'甲氧基修饰或硫代修饰。
[0022] 一对引物也属于本发明的保护范围，该对引物由如下（1)和（2)所示的两种分子 组成：
[0023] (1) SEQ ID No. 11 所示的 DNA 分子；
[0024] SEQ ID No. 11所示的DNA分子中的5' -GTCTCCGACTCAG-3'序列与上述任一所述 的5'接头分子的部分序列一致；
[00巧](2) SEQ ID No. 12 所示的 DNA 分子；
[0026] SEQ ID No. 12 所示的 DNA 分子中的 5' -TCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' 序列与上述 一组DNA分子或上述3'接头分子的部分序列互补。
[0027] -种构建Small RNA cDNA文库的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含 上述DNA分子或上述3'接头分子、上述反转录引物、上述任一所述的5'接头分子和所述的 引物组成。
[0028] 上述试剂盒中，所述试剂盒还包含RNA连接酶反应缓冲液、DMS0或阳G、不含核酸 酶的水、截短型T4RNA连接酶2、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏糖醇、反转 录酶、ATP、T4RNA连接酶1、高保真PCR扩增缓冲液、dNTPs和高保真DNA聚合酶。
[0029] 一种分离Small RNA的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：
[0030] (一）提取总 RNA ;
[003。（二）将总RNA转移至超滤柱中，1200化pm离也15min，得滤液；
[0032] (H)转移滤液至管中，加滤液1/10体积的3M NaAc和3倍体积无水己醇，-2(TC冻 存 30min ;
[003引（四）4°C 12000巧m离也30min，去上清，得沉淀；
[0034] (五）在沉淀中加体积百分含量为80%的己醇水溶液，4°C 1200化pm离也5min，去 上清，风干得沉淀；
[0035] (六）重复步骤证）一次，得沉淀，即为Small RNA。
[0036] -种构建Small RNA cDNA文库的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：
[0037] (-）从样品中分离Smal 1 RNA ;
[0038] (二）在Small RNA分子的3'末端连接上述3'接头分子；
[003引（立）将步骤仁）得到的分子与上述反转录引物退火，得到退火产物；退火产物中 引物与上述3'接头分子互补成双链结构；
[0040] (四）将退火产物进行cDNA第一链的合成；
[0041] (五）在步骤（四）的产物的5'末端连接上述任一所述的5'接头分子；
[0042] (六)W步骤(五)的产物为模板，W上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物；
[004引（走）回收PCR扩增产物中长度为100 +lObp条带，进行纯化，得Small RNA cDNA 文库；
[0044] 所述步骤(一）中分离Small RNA的方法具体为上述分离Small RNA的方法；
[0045] 上述方法中，所述步骤(二）的具体步骤如下：
[0046] (-）将步骤(一）分离的Small RNA、上述3'接头分子、RNA连接酶反应缓冲液、 DMS0或阳G、不含核酸酶的水混合，得体系1 ;将体系1置于95C 30s，立即冰上放置2min， 得反应液1 ;
[0047] 所述体系1的体积为13.加1，所述Small RNA在体系1中的质量大于等于45ng， 所述3'接头分子在体系1中的质量为2X 1〇41 y mol,所述RNA连接酶反应缓冲液的商品名 称为T4RNA Ligase Reaction Buffer,购自肥B公司，产品目录号为B0216,所述DMS0在体 系1中的体积百分含量为5-20%，或所述PEG在体系1中的体积百分含量为10-50% ;
[004引（二）在反应液1中加入截短型T4RNA连接酶2和RNA酶抑制剂，得体系2 ;将体系 2置于22C连接1-2小时，得到在3'末端连接上述3'接头分子的Small RNA分子；
[0049] 所述体系2的体积为15ul，所述截短型T4RNA连接酶2在体系2中的酶活为300U， 所述RNA酶抑制剂在体系2中的酶活为20U ;
[0050] 所述截短型T4RNA连接酶2的商品名称为T4RNA Ligase2, truncated,购自肥B公 司，产品目录号为M0242 ;
[0051] 所述化aseOut购自Life Technologies公司，产品目录号为10777-019。
[0052] 上述任一所述的方法中，所述步骤(H)的具体步骤如下：
[0053] 将步骤(二)得到的产物与上述反转录引物混合，得体系3 ;将体系3置于9(TC 30s， 5(TC 5min，然后25°C放置lOmin，得到退火产物；
[0054] 所述体系3的体积为16ul，所述步骤(二）得到的产物在体系3中的体积为15ul， 所述反转录引物中各引物的质量为5Xl(Ti 2mol。
[00巧]上述任一所述的方法中，所述步骤（四）的具体步骤如下：
[0056] 将退火产物与不含核酸酶的水、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏 糖醇、反转录酶混合，进行cDNA第一链的合成。
[0057] 上述任一所述的方法中，所述步骤(五）的具体步骤如下：
[005引将步骤（四）的产物与上述任一所述的5'接头分子、ATP、T4RNA连接酶1混合，得 体系4 ;将体系4置于2(TC连接1小时，得连接产物；
[005引所述体系4的体积为20ul，所述步骤（四）的产物在体系4中的体积为16ul，所述 T4RNA连接酶1的酶活为20U，所述ATP在体系4中的浓度为ImM，所述5'接头分子在体系 4中的浓度为luM ;
[0060] 所述T4RNA连接酶1的商品名称为T4RNA Ligasel，购自肥B公司，产品目录号为 麵0204。
[0061] 上述任一所述的方法中，所述步骤(走）的纯化方法具体步骤如下：
[006引将步骤(六）得到产物进行PAGE凝胶电泳，切下长度为lOO + lObp的凝胶条带，用 0. 3M化C1浸泡，将凝胶转移至凝胶过滤管中，收集滤液；加入1 y L用d地20配制的20mg/ mL糖原W及2-5倍体积的无水己醇，-2(TC放置半小时，12000巧m离也，弃上清，加入体积 百分含量为80%的己醇水溶液；1200