专利名称：一种构建cDNA文库的方法
技术领域：
本发明公开一种构建cDNA文库的方法，利用T-载体快速构建cDNA文库是 基因工程技术中的一种分离鉴定功能基因的方法，属分子生物学范畴。
背景技术：
构建cDNA文库是鉴定未知生物基因组功能基因的一种有效手段，从1975 年Rougeon等人第一次成功构建cDNA文库以来，各种构建文库的方法不断涌现， 技术手段也越来越成熟，其主要的技术手段不外乎包括采用polyd(T)寡聚糖 核苷酸与mRNA的poly (A)互补配对为引物，以mRNA为模板通过RNA反转录酶 催化合成第一条cDNA链。然后通过DNA聚合酶合成第二条cDNA链。为了将合 成的cDNA克隆到载体中，通常需要在双链cDNA两端加上两个带有特异酶切位 点的接头引物，另外为了在酶切接头引物时不至于将cDNA切断，往往需要将所 合成的cDNA甲基化。切割完成后连接到载体中，最后进行cDNA文库构建。这 些方法都涉及到接头引物和酶切等复杂程序，操作太繁琐，且成功率不是很高， 更不能轻易采用对微量宝贵样品建库。虽然最近也有采用噬菌体插入/切除位点 特异性重组系统(即GATEWAYTM系统)连接cDNA到载体的报道，但这种重组的效 率是有待提高的，而且用于重组的Clonas^酶非常昂贵，在推广上有一定难度。 总之，现在还没有-种既简单经济，又快速高效，既不需要大量RNA样品，又 能高通量、高成功率的构建cDNA文库的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建cDNA文库的方法，既不需要核酸内切酶也不 需要噬菌体插入/切除位点特异性重组系统的构建cDNA文库的高通量、高成功 率的简单方法。
本发明的目的是这样实现的 包括以下步骤
1、
1) 以总RNA或mRNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2为引物，以 Invitrogen公司的Superscript II为反转录酶合成cDNA第一条链；
2) 以cDNA第一条链为模板，以SEQIDNo. l和SEQIDNo. 2为引物，以DNA 聚合酶通过PCR扩增合成双链cDNA;
3) 将步骤2)合成的双链cDNA直接通过T4 DNA连接酶连接到T-载体中， 将载体通过转化导入大肠杆菌，得到cDNA文库。
2、 步骤1 ) SEQ ID No. 1为一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端为GGG，其余 序列为任意一段特异性接头引物序列。
3、 步骤1 ) SEQ ID No. 2为一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端为15_30个胸 腺嘧啶脱氧核苷T和VN序列，5'末端为明显不同于SEQ ID No. 1的任意一段 15-30bp的特异性接头引物序列。
4、 步骤2)用于合成双链cDNA的DNA聚合酶为具有添加腺嘌呤脱氧核苷A粘 性末端功能的Taq DNA聚合酶。
5、 步骤3)所述的T-载体指两端都带有突出胸腺嘧啶脱氧核苷T粘性末端的 载体。
本发明的核心步骤为使用Taq DNA聚合酶通过PCR合成cDNA的第二条链， 利用Taq DNA聚合酶在DNA合成完成后的加尾特性，保证合成的双链cDNA两个 末端均为A粘性末端，这样的双链DNA可以在T4-DNA连接酶作用下和带有两个 T粘性末端的T-载体连接，之后通过转化完成cDNA文库的构建。
如图1所示，该发明的具体实施步骤如下
A.第一条链的合成 将以下药剂加入灭菌过的无菌离心管中
1-3 ul RNA样品(大约l.Oug总RNA)
lu 1 引物SEQ ID No. 1
lul 引物SEQ ID No. 2
加双蒸水至5li 1
将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后72。C温浴2分钟，然 后放置冰上2min。然后加入以下试剂 2. 0 u 1 5X第一条链缓冲液
1. 0 u 1 DTT (20 mM)
1. 0 u 1 dNTP Mix (10 mM )
1.0 ul SuperScriptII反转录酶 总体积为IO.O ul
将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后42。C温浴60分钟。反 应完成后，将离心管放在冰上终止反应。 B.通过PCR合成cDNA第二条链
将以下药剂加入灭菌过的无菌离心管中
2 yl 第一条cDNA链
80 ul H20
10 y 110X PCR缓冲液
2 11 1 50X dNTP Mix
2 u 1 引物SEQ ID No. 1
2 u 1 引物SEQ ID No. 2
2 1 Taq Polymerase
总体积为IOO Hi
将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后放置到PCR仪里进 行PCR反应，反应程序为 95° C1 min
<formula>formula see original document page 6</formula>反应完成后，将5u 1 PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，以鉴定cDNA产物的 合成效果。如果想要获得大片段的cDNA文库，可以将全部PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳，然后根据需要将DNA片段进行琼脂糖凝胶回收，利用异丙醇和70% 乙醇纯化和浓縮后，才进行下面的T-载体连接，否则可以直接将双链cDNA用异 丙醇和70%乙醇纯化和浓缩之10 u 1总体积，在进行T-载体连接。
C. 双链cDNA与T-载体的连接
10 ul 浓縮后的双链cDNA
5 u 1 T-载体
3 u 1 T4 DNA连接酶
2 u ] T4 DNA连接酶缓冲液
混合后在16° C过夜连接。
D. 将连接物与大肠杆菌电激点击感受态混合，然后在BioRad MicroPulser 电转仪上进行电激转化，获得cDNA文库。
该发明的主要优点是(l)RNA使用量少，原则上只需要0.05-L0 ug的 总RNA就可满足构建文库的要求。(2)操作简单，因为5'接头引物在合成cDNA 第一条链时利用S叩erScriptII的加尾功能和底物转换巧妙添加上去，而3'端 引物则直接添加在Poly d(T)上，cDNA第二条链的合成则通过PCR扩增完成。 此外，合成双链cDNA时巧妙利用Taq DNA聚合酶的加尾功能，使PCR产物自动 带有粘性A末端，可以高通量地与带有T粘性末端的T-载体直接连接，避免接 头的酶切过程，所以操作简单。(3)操作简洁，合成--次cDNA第-条链可以
进行5次双链cDNA的PCR扩增，保证构建文库的高成功率。(4)应用此方法
构建文库几乎没有使用任何昂贵试剂，所以费用低廉。
图l为本发明的技术路线图2为PCR扩增得到红树的双链cDNA，取5 u 1在1. 2。/。的琼脂糖凝上进行 电泳，最左边为lkb DNA marker;
图3为红树cDNA文库单菌落PCR扩增结果，PCR产物在1. 2%的琼脂糖凝上 进行电泳，最左边为lkb DNA marker。
具体实施例方式
构建红树植物红海榄的cDNA文库
红树植物由于常年生长在海边，具有很强的耐盐耐涝能力，其组织内的内 含物也特别丰富，如多糖和蛋白，大量内含物会增加提取红树的RNA的难度和 影响提取RNA的质量，因此构建高质量的红树的cDNA文库难度就相对较大，利 用本发明，我们按照下列步骤构建红树cDNA文库。
本发明对SEQ ID No. 1引物的要求为 一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端 为GGG，其余序列为任意一段特异性接头引物序列。本发明对SEQ ID No. 2引物 的要求为 一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端为15-30个胸腺嘧啶脱氧核苷T 和VN序列，5，端为明显不同于SEQ ID No. 1的任意一段15-30bp的特异性接 头引物序列。本实验以下面两个满足该要求的引物为例构建红树cDNA文库。
SEQ ID No. 1: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG;
V代表:G,或C，或A; N代表A，或C，或G， 或T。 (1)红树cDNA第一条链的合成
将3ul红树RNA样品(大约1.0ug总RNA)与10uM的引物SEQ ID No. l和引物
SEQ ID No.2各lyl在无菌离心管中混合，然后72"C温浴2分钟，然后放置冰上
2min。然后加入以下试剂
2.0 wl 5X第一条链缓冲液
1. 0 u 1 DTT (20 mM)
1.0 u 1 譜P Mix (10 mM )
1.0 yl SuperScriptII反转录酶
将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后42。C空气温浴60分 钟。反应时间完成后，将离心管放在冰上终止反应。 (2)通过PCR合成cDNA第二条链
将以下药剂加入灭菌过的无菌离心管中 2 ul 红树cDNA第一条链 80 li 1 H20 10 u 110X PCR缓冲液 2 ti 1 10mM dNTP Mix
2 u 1 引物SEQ ID No. 1
2 1 引物SEQ ID No. 2
2 ti 1 TaKaRa LD Taq Polymerase
将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后放置到PCR仪 (Perkin Elme，GeneAmp 9600)里进行PCR反应，反应程序为
95°C1 min95。C20 sec68。C6 min
16°C---
25循环
反应完成后吸5u 1 PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，大部分的 cDNA集中在750—3000bp之间，表明cDNA具有较好的完整性。将余下的95 y 1
双链cDNA用异丙醇和70V酒精沉淀，然后将沉淀的c咖A溶于10 u 1水。
(3) 双链cDNA与T-载体的连接
10 ul 浓缩后的双链cDNA 5 u 1 pMD-20 T-载体(TaKaRa)
3 ti 1 T4 DNA连接酶(Fermentas)
2 u 1 T4 DNA连接酶缓冲液
混合后在16° C过夜连接。
(4) 大肠杆菌转化
20 ul连接物和200 wl电击感受态大肠杆菌混合，然后进行电击转化， 取1 1^1在含氨苄霉素,X-gal和IPTG的LB平板培养基上进行涂布筛选，通过 蓝白斑可以确定正确的转化菌斑，经计算，每1 w g总RNA可以获得10H的转化 菌斑。最后利用菌落PCR来检测cDNA文库，如图3所示，大部分cDNA的长度 在500-2000bp之间，证明所构建的文库质量很好。
权利要求
1、一种构建cDNA文库的方法，包括以下步骤1)以总RNA或mRNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以Invitrogen公司的SuperScript II为反转录酶合成cDNA第一条链；2)以cDNA第一条链为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以DNA聚合酶通过PCR扩增合成双链cDNA；3)将步骤2)合成的双链cDNA直接通过T4 DNA连接酶连接到T-载体中，将载体通过转化导入大肠杆菌，得到cDNA文库。
2、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于步骤l ) SEQ ID No. 1为一段寡 聚脱氧核苷酸序列，3'末端为GGG，其余序列为任意一段特异性接头引物序列。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤l ) SEQ ID No. 2为一段寡 聚脱氧核苷酸序列，3'末端为15-30个胸腺嘧啶脱氧核苷T和VN序列，5'端 为明显不同于SEQ ID No. 1的任意一段15-30bp的特异性接头引物序列。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在丁步骤2)用于合成双链cDNA的 DNA聚合酶为具有添加腺嘌呤脱氧核苷A粘性末端功能的Taq DNA聚合酶。
5、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于步骤3)所述的T-载体指两端 都带有突出胸腺嘧啶脱氧核苷T粘性末端的载体。
全文摘要
本发明公开一种构建cDNA文库的方法，其特点是简单快速而且不需要核酸内切酶。该方法的主要步骤包括(1)以总RNA(或者mRNA)为模板，利用这对引物通过反转录合成cDNA第一条链。(2)利用这对引物通过Taq DNA合成酶催化的PCR合成cDNA第二条链。(3)将步骤(2)得到的PCR产物通过DNA连接酶直接与T-载体连接，然后转化大肠杆菌感受态，得到cDNA文库。本发明的方法构建cDNA文库成本极低，RNA模板需要量很少，而且适用于任何来源生物样品RNA。
文档编号C40B50/06GK101377021SQ20081016857
公开日2009年3月4日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者徐远峰, 翟金玲, 惜 黄 申请人:海南大学