专利名称：一种外指引序列文库构建方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种外指引序列文库构建方 法，从而方便从文库中筛选出可用作基因治疗意义的外指引序列EGS。
背景技术：
外指引序列(External Guided Sequence,以下均简称EGS)技术于80年代后期首先 发现，其主要功能是体内定向灭活功能基因，EGS为小分子RNA功能分子，因而应该 属于广义的RNA干扰技术(RNAi)。但与目前流行的RNAi技术不同的是，EGS采用 更短的RNA分子(10mer)，即可特异作用于耙基因，从而导致靶基因定向灭活。目前 针对EGS的国际专利已存在，但美国专利说明书US6057153、 US6783981和US5877162 等主要是针对单个EGS分子的设计。目前仍没有实用的可用于高通量EGS的筛选的EGS 文库(简称LEGS),而这种文库的产生将有益于针对特殊疾病如爱滋病、肝炎及癌症等 的基因新药开发。
发明内容
本发明的内容是EGS文库的构建，更具体地，本发明公开了一种EGS文库的构建 方法首先通过涉及EGS文库的设计框架对其进行修饰得到EGS的理论文库，然后将 EGS理论文库的表达框克隆至pET28a载体构建重组载体，后将重组载体转化至感受态 细胞以筛选阳性克隆。
图1为EGS文库设计图，其中
图1-1: "3/4 EGS"设计框架来源于大肠杆菌酪氨酸转运RNA的前体序列；
图l-2:外指引序列文库，外指引序列识别结构域由随机碱基组成；为了避免
"CCA"序列直接暴露给核酸酶，"UUU"序列连接在它的3'末端；
图1-3:外指引序列文库与潜在的靶标RNA形成的复合体，箭头指示了核酸
酶P的切割位点。
3图2为引物FLEGSp和RLEGSp示意图；部分随机化的寡聚核苷酸FLEGSp和 RLEGSp由两部分组成， 一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子和T7 终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列文库表 达框；
图3为EGS文库构建示意图，其中
图3-1: pET28a-LEGS构建的流程图3-2: pET28a-LEGS的PCR产物鉴定图，箭头指示了大小为5-kb的DNA 条带；
图4为EGS文库鉴定示意图，其中
图4-1: pET28a-EGS克隆酶切鉴定模式图，RV1泳道为含一个Hindi酶切位点 的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切示意图，RV2泳道为含二或三个 HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，V泳道为 pET28a被Hindi酶切后的酶切示意图,箭头指示了大小为5-kb的DNA条带； 图4-2: pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1到42号泳道均为含一个HincII酶 切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a被 HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带； 图4-3: pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1号泳道均为为含两个或三个HincII 酶切位点的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a 被HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带； 图4-4:部分EGS表达框序列的多重比较结果。
图5为体外转录制备EGS示意图，其中 图5-l: EGS制备流程图； 图5-2: EGS的体外转录模板鉴定图5-3:转录制备的EGS产物；
图6为EGS文库功能筛选意图，其中
图6-l:体外筛选功能性EGS示意图6-2:功能性EGS体内验证示意图； 图7为EGS-c-myc功能鉴定示意图，其中图7-l:为EGS-c-myc结构示意图7-2:为EGS-D-c-myc结构示意图(EGS-c-myc的阴性对照)，园形标记标示 了碱基突变；
图7-3:为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产物的示意图，泳道M 为RNA Marker,箭头指示了大小为2-kb的RNA条带，星号指示了大小为 0.5-kb的RNA条带，泳道1为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产 物；
图7-4为c-myc表达水平检测结果，其中
图7-4-1为荧光实时定量PCR检测结果，
图7-4-2:为Western biota检测结果； 图7-5为细胞凋亡检测结果，其中
图7-5-1:为EGS-D-c-myc所导致的凋亡率；
图7-5-2: EGS-c-myc所导致的凋亡率。
具体实施例方式
1、 EGS文库的设计
1.1选择"3/4EGS"(图1-1)作为EGS文库的设计框架。"3/4 EGS"的一级结构(核 酸序列)和二级结构来源于大肠杆菌(五sc&WcWa co//)的酪氨酸转运RNA(tRNATyr)， 其已被广泛采用并被大量实验结果验证。
1.2"3/4EGS"的耙标配对区域由随机碱基组成，这就是EGS的理论文库(图1-2)。
1.3在"3/4 EGS"最3'端的"CCA"序列的末端添加"UUU"序列以避免"CCA"序列直 接暴露于核酸酶(RNAase)(图1-2)。
因该文库包含了靶向任何靶标RNA的功能性EGS (图1-3)，故该文库也可被称为 EGS随机文库。
2、 EGS文库的构建策略
通过替换T7终止子和T7启动子之间的区域，EGS文库的表达框被克隆至pET28a 载体而构建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS为含有EGS文库表达框的重组载体，其中EGS 文库表达框的转录受T7终止子和T7启动子的控制。把pET28a-LEGS转化至DH5a感
5受态细胞中以筛选pET28a-EGS-clone——含有某一特定EGS表达框的重组载体，其中 EGS文库表达框的转录受T7终止子和T7启动子的控制(图3-1)。
此策略基于PCR技术直接把EGS文库表达框克隆至目标载体，这可避免EGS文库 中某些表达框被遗漏。
3、 EGS文库的构建方法
3.1利用Vector NTI软件设计引物FLEGSp SEQ ID NO:l和RLEGSp SEQ ID NO:2 (图2)第二个引物是RLEGSp。
这对引物由两部分组成， 一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子 和T7终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列 文库表达框。这可通过PCR技术直接把EGS文库表达框克隆至目标载体。
3.2利用9700 DNA synthesizer (Applied biosystem)合成FLEGSp和FLEGSp，并对
它们的5'端进行磷酸化修饰。
3.3利用Phusion High-Fidelity PCR Kit (NEB)按照以下反应体系和反应程序在 9700 Thermal cycler(Applied biosystem)进行PCR扩增(图3-2)。通过PCR扩增把EGS 的理论文库的表达框克隆至pET28a载体(MERCK公司)而制备pET28a-LEGSL。
图3-2结果显示PCR产物大小与理论预测一致。
反应体系:
组分各组分所占体积(按50pl 反应体系计算)终浓度
高保真性DNA聚合酶的10微升lx
反应缓冲液(5x)
10mM的dNTP混合物l微升200微摩/个
引物A(10微摩)2.5微升0.5微摩
引物B(10微摩)2.5微升0.5微摩
6扩增模板(1纳克/微升)0.5微升0.01纳克/微升
高保真性DNA聚合酶0.5微升0.02个反应单位/微升
超纯水33微升
反应程序反应步骤反应温度反应时间反应的循环次数
预变性98 °Cl分钟1次
变性98 °C5秒
退火70 °C15秒30次
延伸72 °C90秒
再延伸72 °C10分钟1次
3.4利用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (Omega)纯化PCR产物(图3)。
用紫外分光光度计DU530 (Beckman)测量纯化的PCR产物的浓度。
3.5利用T4DNALigase (NEB)对纯化的PCR产物进行分子内连接。DNA浓度越 稀，越容易发生分子内连接，参照以下计算式51.1/(DNA浓度g/l) + (分子量dalton) 0.5>2，计算连接反应体系内PCR产物的浓度为lng/pl。根据计算结果，取lug pET28a-LEGSL进行连接，反应体积为lml，连接反应条件为15°C， 16h。
3.6连接产物进行乙醇沉淀纯化，纯化的连接产物按照一定比例(小于或等于1:10) 与感受态细胞(DH5a:购置于Invitrogen公司)充分混匀，冰浴30min; 42°C， 45S，冰浴 2-3min;加入10体积LB培养基，37°C， 225r/min，振荡培养lh;取小量上述培养物(剩 余培养物放置4'C保存)进行梯度稀释并分别涂布于含30pg/ml Kanamycin的LB平板， 37°C，哺乳动物倒扣培养约14h。观察计算上述培养板的克隆数。根据计算结果，把剩余培养物进行稀释(使每个平板长出约300个克隆)并涂布于的若干个LB平板(含 30|ag/ml Kanamycin)。
pET28a-LEGSL的理论大小为5143bp，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ——pET28a-LEGSL的片段长度均符合理论大小(图3-2);对纯化的pET28a-LEGSL 进行分子内连接；连接产物分别转化至感受态细胞DH5a，转化产物在含30pg/rnl的LB 平板上进行克隆筛选。其转化效率为3.72xl0々昭。
3.7利用VectorNTI软件对pET28a-LEGS的序列进行酶切位点分析——选择限制性 内切酶HincII对上述质粒分别进行酶切鉴定(图4-2)。
3.8利用Vector NTI软件设计测序引物，用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceing Kit (ABI) 和3730 DNA Analyzer (ABI)进行双向测序分析(图4),测 序结果见图4-3。
pET28a载体具有两个酶切位点，其中一个位于被EGS文库表达框替换的T7 prometer和T7 terminator之间的区域内，但EGS表达框以不同的的概率引入0、 1或2 个历"dl酶切位点。理论上，大概98% pET28a-EGS-clone只有1个历"cll酶切位点， 其/Z/"cII酶切图谱为(图4-1， laneRVl),大概2% pET28a-EGS-clone具有2个或3个 ///"dl酶切位点，它们的/f/"cII酶切图谱为(图4-1, laneRV2)。 为了检验EGS文 库的克隆效率是否符合理论设计，随机挑取pET28a-EGS-clone进行限制性内切酶
(历"cll)分析。大概96% pET28a-EGS-clone的///"ell酶切图谱与理论预测一致，其中 94%pET28a-EGS-clone的招"cll酶切图谱(图4-2)与图4-1， laneRVl—致，其中6% pET28a-EGS-clone的历"cll酶切图谱(图4-3， lanel)与图4-1， laneRV2—致。上述 酶切分析表明EGS文库克隆效率基本满足理论设计要求。为了检验EGS文库的EGS表 达框的组成是否符合理论设计，随机挑取pET28a-EGS-clone进行测序及比对分析。大 概94%pET28a-EGS-clone具有序列玩全正确的EGS表达框。对这些EGS表达框的序列 进行比对分析(图4-4)表明，EGS表达框的组成满足理论设计。
EGS文库应用实例
一、EGS文库筛选程序的建立
1 、以EGS克隆(pET28a-EGS-clone)为模板，对EGS表达框进行PCR扩增(图5-1);
82、 以上述纯化的PCR产物为模板，对EGS进行转录制备(图5-1);
EGS-clone的制备流程如图5-1所示。PCR扩增EGS-clone-1VTT。 EGS-clone -IVTT 理论大小为826bp。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析——EGS-clone -IVTT(图5-2) 的片段大小符合理论预测。以纯化的EGS-clone-IVTT为模板，通过体外转录制备 EGS-clone。 EGS-clone的理论大小为71bp，对所制备的EGS进行琼脂糖凝胶电泳分析 ——EGS-clone (图5-3)的片段大小符合理论预测。
3、 把上述纯化的体外转录产物与靶标RNA(爱滋病、肝癌相关的致病基因)以及 RNaseP混合反应，以体外筛选功能EGS (图6-1);
3.1 RNaseP制备
RNaseP由C5蛋白和Ml RNA组成，参考文献报道(Lundblad EW, Xiao Q Ko JH, Altaian S. Rapid selection of accessible and cleavable sites in RNA by Escherichia coli RNase P and random external guide sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2008; 105:2354-2357.)方法进行 制备。
3.2耙标RNA制备
获取靶标RNA的体外转录模板(5'端含有T7启动子)，通过体外转录制备靶标RNA。 3.3 RNA纯化
利用RNA纯化试剂盒(QIAGEN)，对体外转录产物进行纯化。
3.4反应条件
组分终浓度 反应温度反应时间
EGS300nM
耙标RNA30nMPA反应缓冲液50 mM Tris「HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, and mM NH4C1混匀室温5分钟
RNasePC5蛋白200nM
Ml RNA20nM混匀37 °C30分钟
3.5反应产物分析
对反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度为8%,含7M尿素)分析，以判断
9靶标RNA是否被特异性切割。
上述所述实验步骤为EGS体外筛选策略，如图6-l所示。
4、把上述筛选到得功能性EGS转染至相应的细胞模型，并对其所导致的表型(增 殖抑制、促进凋亡、抑制病毒感染)进行验证分析(图6-2)。
4.1 EGS转染
利用转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)，被EGS转染至靶标细胞，详细操作见 转染试剂说明书。
4.2细胞增殖检测
利用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Beyotime)进行细胞增殖检测，详细 操作见试剂盒说明书。
4.3细胞凋亡检测
利用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime)进行细胞凋亡检测，详细 操作见试剂盒说明书。
4.4病毒拷贝数检测(以HIV为例)
利用慢病毒基因组RNA拷贝数检测试剂盒Lenti-X qRT-PCR Titration Kit对HIV
基因组RNA拷贝数进行检测，以评价HIV的增殖情况。
上述所述实验步骤为EGS体内验证策略，如图6-2所示 二、 EGS文库筛选结果
通过上述筛选程序，体外筛选到靶向肝癌c-myc癌基因的EGS-c-myc SEQ ID NO.3; 体内实验结果表明EGS-c-myc能够有效干扰肝癌细胞系HepG2中c-myc的表达，并 诱导HepG2发生凋亡(图7)。
1 、体外筛选靶向c-myc癌基因的EGS-c-myc (图7-1)
利用上述体外筛选程序，筛选到在体外可诱导RNase P对c-myc癌基因进行有效识别切 割的EGS-c-myc (图7-1 )， EGS-c-myc能够在体外指导RNaseP对c-myc mRNA进行特 异性切割，其切割产物鉴定如图7-3所示.
102、 制备EGS-c-myc的体内阴性对照EGS-D-c-myc (图7-2)
利用制备EGS-c-myc的方法制备EGS-D-c-myc，但在对EGS-c-myc表达框进行PCR扩 增时引入碱基突变(UUC—AAG)。
EGS-D-c-myc的结构示意图如图7-2所示。
3、 把EGS-c-myc禾Q EGS-D-c-myc分别转染至HepG2细胞利用转染试剂 Lipofectamine 2000 (Invitrogen),被EGS转染至靶标细胞，详细操作见转染试剂说明书。
4、 EGS-c-myc和EGS-D-c-myc对c-myc表达水平的影响 4.1荧光实时定量PCR分析(图7-4-1)
A、 HepG2细胞被EGS转染72h后，利用Trizol reagent (Invitrogen)提取总RNA，
详细操作见试剂说明书；
B、 反转录试剂盒(QuantiTectRev. Transcription Kit, QIAGEN)对上述提取的RNA 进行反转录，详细操作见试剂盒说明书；
C、 利用Q-PCR (SYBR法)试剂盒(QuantiTectSYBR Green PCR Kits ， QIAGEN) 对卩-actin和c-myc基因进行定量,试剂盒包含对p-actin和c-myc基因进行定量的Q-PCR 引物，P-actin作为内参，详细操作见试剂盒说明书。
图7-4-1结表明EGS-c-myc相比其阴性对照EGS-D-c-myc显著地抑制c-myc癌基因 在转录水平上的表达。
4.2 Western blot分析(图7-4陽2 )
A、 HepG2细胞被EGS转染72h后，利用Western及IP细胞裂解液(Beyotime) 制备蛋白质样品，详细操作见试剂盒说明书；
B、 利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)对上述蛋白质样品进行浓度测定， 详细操作见试剂盒说明书；
C、 对上述蛋白质样品进行SDS-PAGE，上样量为IO吗；
D、 印迹分析印迹膜为硝酸纤维素膜， 一抗为p-Actin(9):sc-130301,mouse monoclonal, Santa Cruz, 1:500，用于检测卩-Actin; c-Myc (A-14): sc-789， rabbit polyclonal
11Santa Cruz, 1:500 ，用于检测c-Myc ， 二抗HRP-标记的羊抗兔IgG (sc-2004, Santa Cruz, 1:2000)、 HRP-标记的羊抗鼠IgG( sc-2005, Santa Cruz, 1:5000);化学发光检测试剂盒 BeyoECLPlus (Beyotime)，详细操作见试剂说明书。
图7-4-2结果表明EGS-c-myc相比其阴性对照EGS-D-c-myc显著地抑制c-myc癌基 因在蛋白质水平上的表达。
5、 EGS-c-myc和EGS-D-c-myc诱导细胞凋亡的效果
利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime)检测EGS-c-myc (图7-5-1) 和EGS-D-c-myc (图7-5-2)诱导细胞凋亡的效果，详细操作见试剂盒说明书。
结果表明EGS-c-myc (图7-5-1)相比其阴性对照EGS-D-c-myc (图7-5-2)显著地 促进HepG2细胞的凋亡。
上述结果表明，本发明的EGS-c-myc可以用于制备预防和/或治疗c-myc癌基因高 表达疾病药物，c-myc癌基因高表达疾病包括但不限于成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、 脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤，肝癌。SEQUENCE LISTING
<110>广州金琪基因技术研究发展中心
<120> —种新的外指引序列(EGS)文库(LEGS)构建技术
<130> US6057153
<160> 2
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221 > misc一feature
<222> (31 )..(37)
<223> n is a， c, g, or t
<400> 1
tctccggggt tccccaatac gattttacca nnnnnnnctt cctaagcttg gaagcttc 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<222> (27)..(29)
<223> n is a, c， g， or t
<400> 2
tcgatgacgg cagatttaga gtcgctnnnt ttggctatag tgagtcgtat taatttcg 58<210> 3 <211> 14 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3
ccagccagcg gtcc 1权利要求
1.一种外指引序列文库构建方法，包括外指引序列文库的设计和外指引序列文库构建两部分，其中引序列文库的设计包括a.选择图1中的“3/4EGS”作为外指引序列文库的设计框架；b.随机碱基组成“3/4EGS”的靶标配对区域作为外指引序列文库的理论文库；c.在“3/4EGS”最3′端的CCA末端添加UUU。
2. 权利要求1所述的外指引序列文库构建方法，其特征在于外指引序列文库构建包括 以下步骤a. 设计引物FLEGSp和FLEGSp并对它们的5'端进行磷酸化修饰，引物FLEGSp的 序列为SEQ ID NO:l ， RLEGSp的DNA序列为SEQ ID NO:2;b. 通过PCR扩增把EGS的理论文库的表达框克隆至载体；c. 纯化PCR产物并对纯化的PCR产物进行分子内连接，后对连接产物进行后处理 从而得到含有外指引序列文库的重组载体。
3. 权利要求2所述的外指引序列文库构建方法，其中步骤b中载体为pET28a。
4. 权利要求2所述的外指引序列文库构建方法，其中步骤b中PCR扩增包括预变性、 变形、退火、延伸再延伸五个步骤。
5. 权利要求2所述的外指引序列文库构建方法，其中步骤c中PCR产物进行分子内连 接的反应条件为15°C， 16小时。
全文摘要
本发明公开了一种新的外指引序列文库构建方法，属于生物医药技术领域。该技术包括EGS文库的设计、构建。本发明公开的EGS文库(LEGS)，是一种采用全新设计思路构建的基因干扰技术文库，将可用于高通量EGS的筛选工作，进而有益于针对特殊疾病如爱滋病、肝炎及癌症等的基因新药开发。
文档编号C40B50/06GK101634048SQ20091016232
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月12日 优先权日2009年8月12日
发明者严启滔, 刘媛媛, 郑文岭, 马文丽 申请人:广州金琪基因技术研究发展中心