大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其调控开花及衰老的作用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆GmCIBl基因和GmCRY2基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中，植物衰老研究已成为植物生命科学研究的重要问题之一。Thimann等 人1978年提出，植物衰老是生长发育过程中一系列的衰退过程（Thimann，1978)。十几年后 Roach提出衰老是随着植物年龄的增长，生存和生殖能力逐渐降低的生理过程（Roach等， 1993)。1997年，Nooden对这一概念进行了完善，提出衰老是植物体细胞程序性死亡的有序 降解过程（Nooden等，1997)。与植物其他衰老事件一样，叶片衰老是发育的最后阶段，最终 叶片死亡，因此限制了叶片的生命周期和寿命。
[0003] 叶片衰老调控进程的阐明有助于我们了解衰老现象和植物生命周期的生物学原 理。植物叶片衰老的分子机制的探索在生物工程应用中影响重大，例如提高植物产量，收后 贮藏，逆境耐受性。
[0004] 迄今为止，通过芯片分析在不同物种中发现大量的SAGS。很多基因可能编码调 控因子，这些调控因子可能是信号感应器和传导器的组成部分，例如转录因子和类受体激 酶。这些调控基因的进一步研究可是一些重要的衰老调控基因被发现同时也为叶片衰老 调控机制研究提供依据。WRKY家族中，WRKY53和WRKY6与叶片衰老相关的功能被深入研 究。WRKY53在衰老早期表达上调但在后期表达量下降，表明WRKY53在衰老早期起调控作用 (Hinderhofer K，2001)。WRKY53包括其他SAGs的靶基因是胁迫相关基因以及转录因子包 括其他WRKY因子。WRKY53敲除突变体的衰老被延迟，而诱导WRKY53过表达则产生早衰， 这表明WRKY53是衰老的正调控子（Miao Y，2004)。通过对WRKY53介导的衰老调控通路的 研究来探索WRKY53的直接下游作用靶基因。另一个WRKY家族转录因子WRKY6,在叶片衰 老和病原菌侵染中其表达量大幅上调（Robatzek S，2002)。WRKY6通过与启动区的W-box 结合来调控基因。很多WRKY6相关基因包括衰老诱导的类受体激酶基因 SIRK与衰老和病 原体响应有关。虽然WRKY6在病原菌防卫和衰老中都起作用，但SIRK仅在衰老阶段表达。 WRKY6敲除突变会改变SAGs的表达但对衰老的影响不明显。这是因为敲除突变体中SAGs 表达的改变可能不足以对叶片衰老变化起到明显作用。也可能是由于WRKY家族成员而产 生的功能冗余。
[0005] NAC蛋白是植物特有的最大转录因子家族之一，拟南芥中该家族就有100多个成 员。NAC家族基因在胚芽和幼芽的分生组织发育，侧根的形成，生长素信号转导和防御响应 中起作用。20个NAC转录因子的表达水平在自然衰老和黑暗诱导的衰老中显著增加 （Guo Y，2006)。NAP编码一个NAC家族转录因子，T-DNA敲除突变体AtNAP表现出衰老延迟表型。 可见AtNAP是叶片衰老的正调控子。水稻中AtNAP的同源基因在衰老叶片中也上调表达。 NAC家族成员间同源二聚化和异源二聚化是该转录因子调控发育过程的重要分子机制，而 这些机制也参与了 NAC转录因子介导的叶片衰老调控。这些基因的功能特点包括它们参与 的信号通路以及调控基因的研究对于叶片衰老复杂分子通路的诠释十分有价值。
[0006] 另一个典型的SAGs是自噬基因，其功能在体内已被研究。拟南芥自噬基因 T-DNA 插入突变体，AtAPG7、AtAPG8、AtAPG18a 表现出早衰现象（Doelling J H，2002;Hanaoka H， 2002 ;Xiong Y，2005)。这些突变体中衰老过程中营养的利用率比较低或者衰老所需的组分 没有被有效的提供，从而导致衰老提前。
[0007] 植物开花调控途径研究已有一百余年的历史，目前至少有四条开花调控的信号 途径被确定，即光周期途径、春化途径、自主途径和赤霉素途径（Amasino, 1996 ;Bemier， 2005)。
[0008] 植物生长过程中受很多外界环境影响，光是重要的环境因素之一。植物中主要有 两种光受体分别感受红光/远红光和蓝光的信号。拟南芥中的光受体研究进展较为突出， 目前拟南芥中已发现的光受体：（1)吸收红光/远红光（波长为600?750nm)的光受体即 光敏色素（phyA，phyB，phyC，phyD，phyE) ; (2)吸收蓝光 /UV-A(波长为 320 ?500nm)的 隐花色素（CRY1，CRY2)、向光素（PH0T1，PH0T2)以及 LOV/F-box/Kelch domain 蛋白（ZTL， FKF，LKP2) ;(3)UV-B(波长为282?320nm)受体UVR8。这些光受体、共同感受光信号，并与 光合色素协同调控植物发育和能量产生。
[0009] 植物响应蓝光早在两个世纪前就有报道，1993年Ahmad和ashmore在拟南芥中利 用T-DNA插入得到一类蓝光不敏感突变体hy4。后来筛选cDNA文库最先分离到第一个蓝光 受体-隐花色素 I (CRYl)。1996年，拟南芥隐花色素2 (CRY2)也被分离得到。在拟南芥中 还发现了无光形态建成功能的CRY3 (Kleine等，2003 ;Huang等，2006)。
[0010] 随后隐花色素在其他植物和其他物种如细菌、动物甚至人体内被鉴定到。不同物 种间隐花色素的同源性虽然有差别，但其功能与拟南芥很相似。即其N端序列与DNA光解 酶高度同源，大都行使光受体的功能。隐花色素可分为：(PD光裂解酶，6-4光裂解酶，植物 隐花色素，动物隐花色素和CRY-DASH五个亚家族。（PD光裂解酶、6-4光裂解酶分别修复环 丁烷嘧啶二聚体、嘧啶-嘧啶酮光产物（Sancar A，2003)。目前研究认为植物与动物隐花色 素均没有光裂解酶活性。CRY-DASH蛋白能够直接绑定DNA或RNA，但是没有光裂解酶的活 性，可通过调控基因转录来调控发育过程（Hitomi K，2000;Brudler R，2003;Worthington E N，2003)。但也有报道说体外的CRY-DASH蛋白，包括拟南芥CRY3，能够修复单链DNA中的 嘧啶二聚体（Huang Y，2006 ;Selby C P，2006 ;Klar T，2007)。
[0011] 蛋白质的结构决定其功能。隐花色素有两个主要的结构域，N端的类似于光解酶 的PHR区和C端不同氨基酸长度的延伸区CCT。PHR结构域与光解酶相似性很高，能绑定隐 花色素中的生色团且参与同源二聚化反应中（Cashmore等，1999 ;Lin和Shalitin, 2003 ; Lin和Todo, 2005)，CCT结构域可通过与蛋白质的相互作用来传递光信号，是隐花色素的效 应区。
[0012] 隐花色素被认为是由光解酶进化而来（Sancar A，2003)。光裂解酶是一类大的黄 素蛋白家族能够修复嘧啶二聚体（Todo等，1996)。由于其作用底物的不同又可分为：修复 环丁烷嘧啶二聚体的CPD光解酶（即光解酶）和修复6-4嘧啶-嘧啶光产物的6-4光解酶。
[0013] 目前发现的光解酶均含两个发色基团即催化基团-核黄素（FAD)和捕光基团-四 氢叶酸MTHF或8-HDF。光裂解酶能结合到DNA嘧啶二聚体上，这种结合不依赖于光。吸收 一个光子后，光解酶启动光修复反应。
[0014] 虽然隐花色素的PHR域序列与光解酶在一级结构上非常相似，均由两部分结构域 构成：N端α/β结构域和C端α螺旋域，这两个结构域通过Loop环相连。但两者的高级 结构差异很大，因此在功能存在很大差别（Brautigam等，2004 ;Huang等，2006)，光解酶具 有光修复功能，隐花色素不能与DNA结合也没有修复嘧啶二聚体的功能。
[0015] 隐花色素与光解酶结构间的差别主要体现在以下几个方面：（I)ATP结合能力。光 解酶的FAD结合区能结合DNA，而隐花色素却结合ATP，前者主要行使修复嘧啶二聚体的功 能，而后者ATP渗入到FAD通道的巢穴中，而磷酸基团靠近PHR表面，这样的构象有利于隐 花色素蓝光依赖的磷酸化反应。（2)表面所带电荷不同。隐花色素表面多带负电荷，而光解 酶多带正电荷，因而后者能结合带负电荷的DNA (Huang等，2006)，表面电势的差异恰好解 释了隐花色素为何不具备光裂解酶修复DNA的活性。隐花色素负电荷的表面进一步支持了 这样一个假说，光照后磷酸化的隐花色素 CCT域会与PHR域分开，导致构象的改变，特异位 点的暴露，使得依赖蓝光的蛋白-蛋白相互作用产生，从而传递光信号。此外，PHR区除了 能捕捉光信号（能量）外还能形成同源二聚体，这对隐花色素正常行使功能至关重要（Sang 等，2005 ;Yu 等，2007a)。
[0016] 隐花色素在C端有一个延伸区即CCT结构域。不同物种隐花色素 CCT序列上差别 较大，但它们含有一个共同的基序-DAS基序（DQXVP-Adidic-STAESSS)，此基序也是一个识 别隐花色素的重要标识（Lin和Shalitin，2003)。CCT结构域是植物和动物隐花色素的功能 效应区，它们可为信号蛋白提供了结构的可塑性，变化的结构可提供更多的蛋白作用位点， 或作用的特异性或亲和性，能识别不同的信号成员或被不同调节蛋白识别，因此在细胞定 位和蛋白相互作用中起到非常重要的作用（Ahmad等，1998b ;Yang等，2000 ;Wang等，2001 ; Lin 和 Todo,2005)。
[0017] 植物隐花色素蓝光依赖的磷酸化和降解途径具体描述如下：
[0018] (1)拟南芥隐花色素蓝光依赖的磷酸化过程
[0019] 拟南芥隐花色素 CRYl和CRY2都会被磷酸化，其主要有以下几个特点：
[0020] 1)蓝光特异的磷酸化过程。将拟南芥黄化苗从黑暗转移到蓝光（> 15μπι〇1 m-2s-l)下在短时间内可检测到隐花色素的磷酸化，而磷酸化活性在黄化苗中检测不到。隐 花色素蓝光特异的磷酸化，随着蓝光强度和光照时间的增加磷酸化程度而随之增加。转移 到红光或远红光下的黄化苗中检测不到磷酸化活性，黄化苗蓝光处理后再转到红光或远红 光下也会很快去磷酸化（Shalitin等，2002, 2003 ;Yu等，2007b)。
[0021] 2)磷酸化过程发生在隐花色素 C端。体外实验显示，从大肠杆菌中表达的拟南芥 CRYlN端和C端蛋白经纯化后进行体外磷酸化检测，结果显示C端有明显的磷酸化信号， 而N端没有；全长CRYl的C端突变后磷酸化也会减少（Ahmad等，1998b)。体内试验显示， 转基因表达GUS-CCT融合蛋白引起拟南芥持续性光响应，而GUS-CCT也是被持续磷酸化的 转基因表达GUS-CCT融合蛋白引起拟南芥持续性光响应，而GUS-CCT也是被持续磷酸化的 (Ahmad等，1998a ;Yu等，2007b)。转基因过表达GFP-CRY2融合蛋白在拟南芥体内具有依赖 蓝光的磷酸化现象，与内源CRY2 -致。过表达CRY2-GFP的拟南芥则具有持续性光响应，同 时该蛋白也拥有持续性的磷酸化过程。转基因 CRY2-GR蛋白在没有地塞米松的情况下定位 于胞质中，CRY2-GR不被磷酸化，过表达的CRY2不能恢复突变体的表型，加了地塞米松处理 后，在GR的带领下CRY2定位到细胞核内，能够被磷酸化，且具有生理活性，恢复了突变体的 正常表型（Tessadori F，2007)。
[0022] 学者们推测磷酸化的隐花色素 CCT表面负电荷打破了与PHR的相互作用，从而影 响了隐花色素与信号成员的互作（Yu等，2007b ;Yang等，2000 ;Liu等，2008 ;Yu等，2009b)。
[0023] 3)自主磷酸化。拟南芥隐花色素 CRYl与蛋白激酶没有序列同源性，但是在体外显 示出自磷酸化活性。目前对于拟南芥隐花色素 CRYl体外自磷酸化的研究存在相反的结果， 有研究报道它是蓝光依赖的、蓝光加强的，也有研究报道它是不依赖于蓝光的（Shalitin D，2003 ;Bouly J P，2003 ;0zgur S，2006)。撇开是否依赖蓝光，至少这些实验结果都证明了 拟南芥CRYl在体外具有自磷酸化活性。拟南芥CRYl的自磷酸化是否足够影响CRYl的磷 酸化，或CRYl依赖蓝光的磷酸化还需要其他激酶的辅助还不是很清楚。目前没有关于拟南 芥CRY2自磷酸化的报道。
[0024] (2)拟南芥CRY2蛋白依赖蓝光的降解活性信号蛋白的一个重要特征就是蛋白的 快速代谢从而使生物体恢复到信号刺激前的状态。与光敏素 PhyA经历依赖红光的快速 降解类似，隐花色素 CRY2也经历依赖蓝光的快速降解，且是通过泛素化/26S蛋白酶体途 径（Shalitin等，2002 ;Yu等，2007b)，而隐花色素 CRYl不具备依赖蓝光的降解活性（Lin， 1998 ;Ahmad M，1998)。有研究显示，在大豆中隐花色素 CRYl的降解依赖于蓝光，而隐花色 素 CRY2在蓝光下不降解（Zhang等，2008)。拟南芥CRY2的降解依赖于FAD，当CRY2突变 (CRY2D387A)丧失结合FAD的能力后，该突变的蛋白不再经历蓝光诱导的降解过程（Liu等， 2008)。CRY2的降解需要持续的高光强的蓝光照射，CRY2依赖蓝光的降解活性同时需要PHR 域和CCT域（Ahmad M，1998)。与此结论一致，持续磷酸化的⑶S-CCT2在蓝光下不降解（Yu， 2007)。CRY2的降解与E3连接酶COPl有关（Wang，2001)，但是COPl不是CRY2唯一的E3 连接酶，因为CRY2的降解在COPl功能降低的突变体copl-4和copl-6中被部分削弱，而在 COPl无效等位基因突变体copl-5中并没有完全消失（Shalitin D，2002)。这些结果暗示 CRY2的降解有可能还牵涉到其他E3连接酶。
[0025] 拟南芥隐花色素 CRY2的磷酸化和降解都是在核内发生，CRY2的磷酸化是CRY2降 解所必须的，CRY2介导蓝光对下胚轴生长的调控和光周期控制的开花也是在核内，说明光 受体CRY2在核内完成了它的整个翻译后生活周期，从蛋白修饰到行使功能再到蛋白降解 (Yu，2009)。
[0026] 从隐花色素 CRYl被发现起，CRY1、它在拟南芥中的同源基因 CRY2、其他物种的同 源基因 CRY广泛的功能被陆续发现。拟南芥隐花色素的功能鉴定主要是通过遗传学方法， 分析CRYl或CRY2基因缺失型突变体cryl、cry2,以及过表达转基因植株CRY1、CRY2的表 型。这些研究证明拟南芥隐花色素 CRYUCRY2分别主要介导了蓝光促进光形态的建成以及 光周期控制的开花。当然，它们还介导了其他蓝光响应，究竟隐花色素是如何协调体内扮演 的不同角色，其调控机理都需要进一步研究与阐明。隐花色素 CRY3T-DNA插入突变体cry3 没有明显的表型改变，其具体的生理功能还不是很清楚。目前的研究主要知道CRY3具有 修复单链DNA的生化活性，有可能参与了细胞器基因组的保护。除了拟南芥，大部分物种 (从细菌到人类）都发现了隐花色素的存在。隐花色素与生物钟密切相关，最近的研究还表 明，隐花色素与生物钟不仅仅与农作物产量有关，还影响了人类健康，包括癌症、睡眠紊乱 以及许多生理上的失调。了解隐花色素和蓝光反应的分子机制，不仅对初步了解生命的基 本过程具有重大的意义，而且在农业和医药方面也具有一定的实用价值。
[0027] 基因的功能往往与其亚细胞定位密切相关。拟南芥隐花色素 CRYl和CRY2基因 在被检测过的所有细胞类型和所有细胞器中都有表达（Ahmad M，1993 ;Lin，1996 ;Toth R， 2001)。隐花色素全方位的表达与其调控多种信号途径相关。用隐花色素内源启动子启动 荧光素酶报告基因的表达，结果显示隐花色素 mRNA的表达几乎不受蓝光影响，但受生物钟 的调控，表达量在光下达到最高值，在暗中降到最低值（Toth R，2001)。隐花色素 CRYl的蛋 白水平不受光影响，CRY2的蛋白水平则在蓝光下降低（Lin，1996)。蛋白水平的变化也与隐 花色素依赖光强的活性相关。在细胞质与细胞核中均能检测到CRYl的表达，其细胞中的表 达量不受光的影响（Wu G，2007)。有报道称核内的CRYl介导蓝光促进膜的去极化、抑制下 胚轴的生长，胞质中的CRYl介导蓝光促进子叶的张开和根的生长（Wu G，2007)。与CRYl不 一样，隐花色素 CRY2主要在核内完成它的整个转录后过程，包括依赖蓝光的磷酸化与降解 (Yu，2007)。核定位的CRY2主要介导了对开花的诱导和对下胚轴生长的抑制（Yu，2007)。也 有报道称核定位的CRY2参与了基因的转录和细胞分裂间期染色质的浓缩（Tessadori F， 2007;Charron J B，2009)。由此可见，基因的定位为其功能提供了线索。
[0028] 植物的光形态建成（又叫去黄化）包括几个形