成异源二聚体，从而改变了它对不同DNA的亲和性。事实证明，至少有四个CIBl相关基 因能够与CIBl或CRY2相互作用，包括CIB1、CIB3、CIB4、CIB5,而其中一些能与CIBl形成 异源二聚体，共同影响CRY2调控基因的表达。与此论点一致的是，单缺失突变体cibl在实 验条件下没有任何表型，而双缺失突变体cbilcib5开花要稍晚于野生型，说明CIB蛋白间 存在功能冗余。将CIBl过表达到野生型背景能够引起早花，而在 crylcry2突变体背景下 没有表型，说明CIBl对开花的促进依赖于隐花色素。对CIBl启动子的检测，发现它在所有 细胞器和细胞类型中均有活性，说明CIBl除了在维管束细胞中与CRY2相互作用调节开花 以外，CIBl蛋白还有可能在其他细胞中与CRY相互作用调控其他光响应基因的表达。当然， 目前已有的检测暗示CIBl有可能不参与CRY对去黄化的调节，因为CIB蛋白单缺失或多缺 失都没有去黄化响应的异常表现（Liu和lin，未发表结果）。
[0051] (2)泛素化E3连接酶COPl
[0052] 泛素化连接酶COPl在植物光形态响应和光受体功能中扮演着重要角色（Deng X W，1992)。功能缺失突变体copl呈现出持续性光形态建成表型，在黑暗下出现短的下胚轴、 张开的子叶、增加的花青素表达以及光诱导基因的错误表达。过表达GUS-CCTl和GUS-CCT2 呈现出cop 1表型，DNA芯片分析，在cop 1中表达改变的基因有80%在⑶S-CCT1和⑶S-CCT2 中的表达也受到影响，相似的表型暗示了功能上的关系，使科学家们开始了对隐花色素和 COPl关系的探讨。在酵母双杂交系统中发现CCTl和CCT2能够与COPl相互作用，在拟南芥 细胞中通过免疫共沉淀鉴定了 CRY2与COPl相互作用，GFP-CCTl与COPl共定位于细胞核 核体中（Wang H，2001)。对蛋白稳定性的调节是光形态建成调控的一个关键点，有研究表 明COPl介导了众多光信号蛋白光依赖的降解，包括HY5/HYH、LAF1、HFR1、CRY2、phyA、C0、 GI(Duek P D，2004;Liu，2008;Shalitin D，2002;Hardtke C S，2000;Jang S，2008)。由此 假设光激活的隐花色素有可能直接或间接与COPl相互作用，抑制它的E3连接酶活性，改变 COPl底物蛋白的稳定性，最终调节植物的发育（Yang，2000 ;Wang H，2001)。另外，隐花色素 与COPl的相互作用是不依赖于蓝光的（Liu，2008 ;Yang，2000 ;Wang H，2001)，这就提出一 个疑问，CRY2是如何介导光对COPl活性的影响呢一种可能就是光照后CRY改变自身生化 活性或COPl的核质分配，另一种可能就是CRY通过光依赖的方式与COPl互作的蛋白相互 作用，来共同影响COPl的活性。
[0053] (3) coiled-coil/WD repeat 蛋白 SPAs
[0054] SPAl是光敏素 phyA特异的信号介导蛋白，在拟南芥中抑制光形态的建成。它包含 WD重复域，序列上高度类似于COPl的WD重复域。SPAl能够与COPl互作，其coiled-coil 域是与COPl互作必须的。SPAl与COPl的互作促进了 COPl对HY5、HFR1的泛素化，介导了 PhyA信号传导（Duek P D，2004 ;Sai jo Y，2003)。SPAl与COPl的互作是光敏感的，光能够 抑制他们的相互作用，抑制COPl的E3泛素化酶活性（Saijo Y，2003, 2008)。但是，究竟光 是如何抑制SPAl与COPl的互作，又如何抑制COPl的活性目前还不清楚。
[0055] 最近的研究显示SPAl能够与CRYl和CRY2相互作用，且是依赖于蓝光和生色团 FAD的，作用强度随蓝光光强的增加而增加。除了 SPA1，拟南芥还有三个SPAl相关基因 SPA2、SPA3、SPA4。SPA4在蓝光下与CRYl和CRY2互作。SPAs基因间有可能存在功能冗余， 共同参与隐花色素调控的蓝光信号途径。研究者们从遗传学角度进一步证实了 SPAs基因 在隐花色素调控蓝光信号途径中的角色。在持续蓝光下，突变体cryl呈现出长的下胚轴， 而spalspa4下胚轴短于野生型，spalspa4cryl的下胚轴略长于野生型但是远短于cryl，说 明SPAs参与了隐花色素调控的下胚轴生长抑制，且位于CRYl的上位。SPAl也参与了 CRY2 依赖的光周期控制的开花途径。长日照下cry2开花晚于野生型，而spal无明显开花表型， 双缺失突变体cry2spal开花时间与spal -致，说明SPAl在CRY2调控光周期控制的开花 途径中位于CRY2的下游。CRYs还介导了蓝光调节SPAs基因转录水平的表达（Sellaro R， 2009)。
[0056] 蓝光响应途径具体描述如下
[0057] (1)CRY2-CIB1 途径
[0058] 拟南芥隐花色素 CRY2与bHLH转录因子CIBl经历了依赖蓝光的互作。CIBl能够 结合FT基因启动子中的E-box，CRY2通过与CIBl的互作，在转录水平调节FT的表达，促进 光周期控制的开花。FT编码一个可移动的转录因子，从叶子移动到顶端分生组织促进开花 基因的表达。CRY2还与CIBl的同源基因互作，体外实验证明CIBl与其他同源基因（CIB3， CIB4, CIB5)形成异源二聚体，结合到FT启动子的E-box。CIB蛋白共同参与了 CRY2的信 号转导途径，促进依赖光周期的花蕾的形成。
[0059] 对于CRY2-CIBS调控途径还有一些问题需要进一步探讨。例如：CRY2是否影响 CIBl结合DNA的亲和力隐花色素是如何介导蓝光影响CIBl的转录活性的另外，CIB蛋白在 没有蓝光的条件下经历泛素化-26S蛋白酶体降解途径，蓝光是如何促进CIB蛋白的稳定性 的呢如何解释CIB蛋白在蓝光下的特异积累与隐花色素 CRY2蓝光下的降解现象除了促进 光周期控制的开花，隐花色素还调控了许多其他响应，CIB是否介入了这些响应途径是否也 存在与CRYl互作的转录因子，使得隐花色素 CRYl从转录水平直接调控基因的表达来传递 光信号
[0060] (2)CRY-SPA1/C0P1途径除了通过与转录因子的互作从转录水平调节基因的表达， 隐花色素还通过转录后机制间接调控基因的表达。隐花色素介导了蓝光对E3连接酶COPl 活性的抑制，例如CRYl介导蓝光抑制了 COPl依赖的转录因子HY5(Long Hyp〇C〇tyl5)、 HYH(HY5Homologue)、HFRl (Long Hypocotylin Far-Redl)蛋白的降解，这些转录因子在去 黄化响应中调节基因的表达，如生长素、油菜素类固醇、赤霉素，以及合成和降解细胞壁的 代谢酶类。CRY2介导了蓝光抑制COPl依赖的转录因子CO(Constans)蛋白的降解，CO是 长日照下促进开花的一个重要成员，它能够在转录水平上促进FT的表达。最近的研究表 明，隐花色素通过与蛋白复合体SPA1/C0P1的互作传递光信号，CRY与COPl的互作不依赖 于光，但是CRY能与COPl互作的蛋白SPAl经历光依赖的相互作用。CRY与SPAl的相互作 用是蓝光特异的，SPAl在遗传上位于CRY的下游。CRY与SPAl依赖蓝光的互作一定程度上 解释了 CRY是如何介导光对COPl功能抑制的。出人意料的是结构相似的CRYl和CRY2与 SPA1/C0P1的互作存在一些差异。在酵母和拟南芥中CRY1-SPA1的互作抑制了 SPA1-C0P1 的互作（Sellaro R，2009;Lian H L，2011;Liu B，2011)，CRYl 以竞争对手的方式介导了 蓝光对COPl活性的抑制，恰好解释了先前的发现：SPA1-C0P1互作受到了光的抑制（Saijo Y，2003)。与CRYl相反，依赖于蓝光的CRY2-SPA1的相互作用并不影响SPA1-C0P1的相互 作用，CRY2-SPA1的相互作用在酵母中加强了 CRY2-C0P1的相互作用，在植物体内促进了 CRY2-C0P1复合体的形成（Zuo Z，2011)。CRY2-SPA1的相互作用促进CRY2-C0P1的相互作 用是通过酵母三杂交检测到的，CRY2-SPA1促进CRY2-C0P1复合体的形成仅在SPAl过表达 的转基因植株中观察到。隐花色素 CRYl和CRY2与SPA1/C0P1相互作用的差异有可能与其 相互作用位点相关。CRYl的C端CCT域与SPAl的C端CC-WD域相互作用，而CRY2的N端 PHR域与SPAl的N端激酶域相互作用。SPA4也与CRYl和CRY2存在依赖蓝光的相互作用。
[0061] 大豆作为一种理想的光周期研究材料已有很长历史，但对其光周期反应的分子生 物学机制至今仍知之甚少。从隐花色素着手研究其光周期反应的分子生物学问题，可以从 信号转导的上游开始理解大豆光周期反应的特点，这样既有利于尽快开拓大豆光周期研究 的新领域，也会为更深入的进行研究提供宝贵经验、打下坚实基础，具有非常重要的理论意 义。之前的研究表明大豆隐花色素 GmCRYl在大豆光周期反应中作用明显，且与拟南芥隐花 色素 CRY2特点相似，而GmCRY2更类似CRY1。GmCRYl与CRY2的相似之处主要表现为：①均 呈现明显的昼夜节律；②均能促进植物开花。所不同的是GmCRYl在CRYl缺失突变体中过 表达，短日下促进开花，而CRY2在长日下促进开花。GmCRY2与CRYl相似之处是，既没有明 显昼夜节律也不能明显促进开花，但GmCRY2蓝光下能降解而CRYl不能（Zhang等，2008)。
[0062] 在大豆中过表达或RNAi敲除GmCRY基因是否能够改变大豆开花对光周期的敏感 性，在本研究之前还没有报道。此外，大豆中的GmCRY是否通过与GmCIB相互作用来进行蓝 光信号传递也不清楚。目前我们在大豆中发现并克隆了 9个与拟南芥CIBl同源的GmCIBs 基因，通过酵母双杂交实验初步验证了 GmCIBl与GmCRY2在蓝光下特异的相互作用。本研 究将通过酵母双杂交、BiFC以及Co-IP等手段研究GmCRYs与GmCIBs蛋白间的相互作用； 进一步获得GmCRY与GmCIBl基因过表达或RNAi敲除的遗传转化大豆株系，结合转基因后 代的表型分析和染色体免疫共沉淀试验（ChIP)结果寻找GmCIBl的下游作用靶基因，分析 大豆中GmCRY传递蓝光信号的GmCIB信号通路，以及GmCRY与GmCIBl基因在大豆衰老调控 中的作用，为大豆光周期的进一步深入研究和种质创新打下基础。
[0063] 发明简述
[0064] 在一个方面中，本发明涉及一种分离的基因，其具有如下的核苷酸序列：
[0065] (I)SEQ ID NO :1或3所示的序列或其互补序列；
[0066] (2)在严格杂交条件下与SEQ ID NO :1或3杂交的序列；
[0067] (3)与SEQ ID N0:1或3具有至少85%、90%、95%或99%同一性的序列，其调控 叶子衰老和开花；或
[0068] (4)由SEQ ID NO :1或3所示的序列通过其中一个或多个核苷酸的缺失、置换、插 入或添加而衍生所得到的序列。
[0069] 在另一个方面中，本发明涉及一种分离的DNA分子，其包含上述的基因及其变体， 该DNA分子具有GmCIBl基因或GmCRY2基因的生物学功能。
[0070] 在另一个方面中，本发明涉及一种重组载体，其包含上述的基因或如DNA分子。
[0071] 在另一个方面中，本发明涉及一种分离的蛋白质，其具有如下的氨基酸序列：
[0072] (I) SEQ ID NO :2或4所示的氨基酸序列；
[0073] (2)由上述的基因编码的序列；或
[0074] (3)包含一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加的SEQ ID NO :2或 4所不的氣基酸序列，该蛋白质具有调控植物叶子哀老和开花的功能。
[0075] 在另一个方面中，本发明涉及一种宿主细胞，其包含上述的基因、DNA分子、重组载 体或蛋白质。
[0076] 在另一个方面中，本发明涉及一种转基因植物，其包含上述的基因、DNA分子、重组 载体或蛋白质。
[0077] 在一个实施方式中，所述的转基因植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南 芥或大豆。
[0078] 在另一个方面中，本发明涉及所述的基因、DNA分子、重组载体或蛋白质在调控植 物叶子衰老和开花中的应用。
[0079] 在一个实施方式中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大 豆。
[0080] 在另一个方面中，本发明涉及一种培育转基因植物的方法，包括将上述的基因导 入目的植物中以获得转基因植物，从而调控所述转基因植物的叶子衰老和开花。
[0081] 在一个实施方式中，培育转基因植物的方法进一步包括获得所述转基因植物的种 子。
[0082] 在一个实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。
[0083] 在另一个方面中，本发明涉及一种调控植物叶子衰老的方法，包括将上述的基因 或载体引入所述植物中以使其在植物中表达，从而调控植物的叶子衰老。
[0084] 在一个实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。
[0085] 在另一个方面中，本发明涉及一种调控植物开花的方法，包括将上述的基因或载 体引入所述植物中以使其在植物中表达，从而调控植物的开花。
[0086] 在一个实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。
[0087] 在另一个方面中，本发明涉及一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含 引入的上述基因、DNA分子或重组载体，或者其重组表达上述的蛋白质，该方法包括获得所 述转基因植物的种子，并通过种植所述种子以获得新的转基因植物。
[0088] 附图简要说明
[0089] 图1显示了大豆CIB基因的染色体定位。
[0090] 图2显示了大豆CIB基因家族成员之间的同源性。
[0091] 图3显示了拟南芥和大豆CIB保守位点分析，箭头（顶部）表示各结构域中保守 的氨基酸。
[0092] 图4显示了大豆CIB基因的基因结构模式。
[0093] 图5显示了大豆CIB在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。
[0094] 图6显示了大豆CIB基因家族在不同组织器官的表达模式。
[0095] 图7显示了大豆CIB基因家族在不同发育时期的表达模式。
[0096] 图8a_8i分别显示了大豆CIB1-9基因的光周期表达模式，其中图8a为CIB3基因 的光周期表达模式，图8b为CIB2基因的光周期表达模式，图8c为大豆CIBl基因的光周期 表达模式，图8d为大豆CIB4基因的光周期表达模式，图8e为大豆CIB5基因的光周期表达 模式，图8f为大豆CIB6基因的光周期表达模式，图8g为大豆CIB7基因的光周期表达模式， 图8h为大豆CIB8基因的光周期表达模式，和图8i为大豆CIB9基因的光周期表达模式，其 中短日照（SD ;8小时光照/16小时黑暗，a和b)或长日照（LD ; 16小时光照/8小时黑暗，c 和d)处理48小时，分别转到连续光照（LL ;a和c)或连续黑暗（DD ;b和d)处理48小时。 标准误差如图所示（η = 3)。
[0097] 图9a_e分别显示了不同纬度来源大豆品种中GmCIBl-9的表达模式，其中图9a 为不同纬度来源大豆品种中GmCIB2&3的表达模式，图9b为不同纬度来源大豆品种中 GmCIBl&4的表达模式，图9c为不同纬度来源大豆品种中GmCIB5&6的表达模式，图9d为不 同纬度来源大豆品种中GmCIB7&8的表达模式，和图9e为不同纬度来源大豆品种中GmCIB9 的表达模式。
[0098] 图10显示了大豆GmCIBl过表达拟南芥转化植株的表型。
[0099] 图11显示了大豆GmCIB4/5/6/8过表达拟南芥转化植株的表型。
[0100] 图12显示了 GmCRYl过表达植株在连续照下衰老相关的表型，其中（A-C):野生型 和GmCRYl-OX转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类（绿 色，没有衰老；黄色，轻度衰老；干枯，完全衰老），每类所占的比例即该类的数目与植株总 数的比值10)。（D-Η):不同衰老阶段植株单叶或子叶的图片。（I) :野生型和两个 GmCRYl-OX转基因植株中GFP-GmCRYl和GmCRYl表达水平的免疫印迹分析。总蛋白提 取物用于10% SDS-PAGE分析，GmCRYl抗体用于免疫杂交。WT，野生型KN18 ;GmCRYl-〇X， GFP-GmCRYl过表达在野生型KN18中。
[0101] 图13显示了 Gm