舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物技术领域，涉及一种亚洲型舞毒蛾的热激蛋白Hsp23基因及 其dsRNA以及基于该基因 RNAi技术在亚洲型舞毒蛾防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 舞毒蛾Linnaeus)是世界性的害虫，分布广，食性杂，据国外 报道可危害300多种植物，国内报道可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500余种植物。 舞毒蛾传播快，繁殖量和取食量大，给林业生产造成重大经济损失，如：1974年舞毒蛾在辽 宁省南部大发生，将许多蚕场的栎叶食尽，杨、柳、榆、山楂、苹果叶等也受到严重危害。目前 对亚洲型舞毒蛾的防治，仍然是以高效氯氰菊酯、溴氰菊酯等化学杀虫剂为主，但这些化合 物容易引起害虫抗药性的形成和环境污染问题。尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防 治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治技术存在受气候环境影响大、见效慢、效果 不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾防治的发展。然而，随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi 技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点。Napoli等（1990)首次发 现RNAi现象，将外源基因引入矮牵牛内会引起内源基因的沉默，当时把这种现象称为"共 抑制"。Fire等（1998)阐述了基因沉默现象的本质，将由dsRNA引发生物体同源序列mRNA 降解而最终导致特异性基因转录后沉默的效应命名为RNA干扰。RNAi技术已经在农林害 虫防治中得到应用。一方面通过基因工程手段将害虫靶标基因 dsRNA转入植物体内，当有 害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力；例 如：Mao等（2007)将含有细胞色素 P450相应序列的dsRNA转基因棉花饲喂棉铃虫，导致棉 铃虫体内P450基因的表达显著降低，最终使棉铃虫解毒能力下降而死亡。Zha等（2011) 将褐飞虱中肠中高表达的己糖转运基因（Λ7//77)，羧肽酶基因（yV/mr)，类胰丝氨酸蛋白酶 dsRNA转入水稻中，当褐飞虱取食携带这些基因的dsRNA转基因水稻时，未出现致 死现象，但靶标基因的转录水平明显下降。另一方面，通过筛选具有致死效应的siRNA (- 般来源于生物体内参与重要生物化学途径的候选基因)，并用化学方法合成，可应用于新型 的杀虫剂生物农药。基于RNAi技术具有对人畜安全，对防治靶标对象专一，对非靶标生物 安全、无害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致"3R"这一难题。
[0003] 昆虫在杀虫剂胁迫下，通过高表达热激蛋白、细胞色素 P450等方式来进行自身的 保护。热激蛋白是在应激条件下产生的，具有分子伴侣功能和耐受性功能，是一类生物体内 广泛存在且高度保守的超基因家族。依据其编码蛋白相对分子量大小对其进行命名，其中 Hsp70和Hsp90家族基因研究广泛而深入。smHsp是一类低分子量蛋白，广泛存在于原核和 真核生物体中的一大类分子伴侣家族，已有研究证实参与细胞的生长、发育、分化及增强机 体的抗氧化作用。由于smHsp家族基因具有这些重要的生理功能，smHsp研究成为当今细 胞生物学、生物化学中一个重要的研究领域。
[0004] 目前，有关通过抑制小分子热激蛋白基因转录水平来防治林木重要害虫舞毒蛾未 见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中 的应用。本发明利用分子生物学手段干扰舞毒蛾潜在的防御基因 Hsp23,不仅降低了昆虫的 生存能力，在舞毒蛾无公害防治中的应用具有广阔的前景并为其他鳞翅目害虫防治提供了 理论依据，而且能使舞毒蛾热激蛋白基因 Hsp23有效的沉默，显著影响舞毒蛾幼虫的生长 发育和生理代谢，为无公害、可持续防治舞毒蛾提供了新思路和新材料。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种亚洲型舞毒蛾热激蛋白基因 Hsp23,其核苷酸序列和编码氨基酸的序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 本发明以亚洲型舞毒蛾Hsp23基因片段为模板，通过MEGAscript RNAi试剂盒 (Ambion)合成Hsp23基因 dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 上述dsRNA在防治舞毒蛾中的应用，主要表现为调控舞毒蛾生长发育。将该dsRNA 微量注射入舞毒蛾3龄幼虫体内，结果表明：Hsp23基因沉默舞毒蛾幼虫8d内体重增加量 小于对照ddH20,且在3d内体重增加量也小于dsRNAGFP ;同时显著影响舞毒蛾营养利用指 标，导致相对取食量、食物利用率、近似消化率较对照显著下降（Ρ〈 0.05)。dsRNA可以高 效特异的沉默昆虫体内Hsp23基因的mRNA表达。
[0009] 克隆本发明中所述的舞毒蛾热激蛋白基因 Hsp23的方法是本领域中所常采用的 方法。本发明中所述的提取舞毒蛾幼虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光 定量RT-PCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒Qiagen、PrimeScript?RT、MEGAscript RNAi Kit、SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo)等都可以从生产商家购买。
[0010] 本发明的优点在于： 1、本发明是国内外首次公开亚洲型舞毒蛾小分子量热激蛋白基因 Hsp23全长核酸序 列，目前关于其抑制表达可显著影响舞毒蛾生长发育的功能未见相关报道。
[0011] 2、将dsRNA注入舞毒蛾3龄幼虫体腔内，高效的沉默了舞毒蛾的靶标基因 Hsp23， 能够导致舞毒蛾幼虫生长发育缓慢，显著影响其正常的生理代谢，从而达到弱化舞毒蛾生 命力的目的，最终达到防治的效果，为此本发明为无公害、可持续防治舞毒蛾提供了新的有 效途径，且Hsp23基因 dsRNA具有广阔的应用前景。
[0012] 3、实验结果表明：当舞毒蛾幼虫注射Hsp23基因 dsRNA后，与对照（注射CldH2O和 GFP基因 dsRNA)相比均有较强的沉默效果，致使舞毒蛾幼虫生长发育受到抑制。因此本发 明提出可利用Hsp23的沉默技术来防治林木重要害虫舞毒蛾及具有相似结构域的鳞翅目 害虫，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
【附图说明】
[0013] 图1为注射dsRNA舞毒蛾3龄幼虫症状； 图2为注射dsRNA舞毒蛾3龄幼虫Hsp23基因表达水平； 图3为舞毒蛾Hsp23基因电泳图； 图4为舞毒蛾Hsp23基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图