灰飞虱热激蛋白Lhsc70 dsRNA序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及利用灰飞虱热激蛋白基因Lhsc70的dsRNA喂 食灰飞虱，由此降低灰飞虱对温度的抗逆性，提高其死亡率，达到杀虫目的。 二、 技术背景
[0002] 灰飞虱LaodelphaxstriatellusFallen是我国重要水稻害虫之一，在所有稻区 均有发生。灰飞虱通过直接刺吸或传播病毒为害水稻、小麦、玉米等，给我国粮食生产带来 巨大危害，在为害严重的地方甚至颗粒无收。灰飞虱种群数量与温度有密切的关系，一年中 对灰飞虱种群发展具有重要抑制作用的是夏季高温。目前研宄表明灰飞虱越夏后存活量决 定了越冬基数，而越冬的起始数量决定了来年的发生量。因此利用基因干扰技术降低灰飞 虱对温度的抗逆性，增加越夏死亡率，可以降低田间灰飞虱种群数量，达到防治的目的。
[0003]RNA干扰（RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高 效特异性降解的现象。其作用机制为细胞质内的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具 有特定长度和结构的小片段的siRNA。siRNA再与体内相应的酶结合形成RNA诱导的沉默 复合物。该复合物有核酸酶的功能，与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合， 在结合部位切割mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA 的降解反应，具有高效、特异、可传播等特性。由于RNA干扰可以特异性剔除或关闭特定基 因的表达，所以被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤等的治疗领域。
[0004] 热激蛋白是一种在生物体内广泛存在的蛋白质，参与生物多种生理反应，帮助肽 链的折叠，在生物抗逆性中扮演重要角色。HSP70是目前研宄得最多的热激蛋白，在动物、植 物、微生物中均有发现。根据表达特性，hsp70可以分为组成型（hsc70)和诱导型（hsp70)。 严格意义上hsc70在生物中正常表达，不受胁迫诱导，而hsp70受胁迫诱导，在正常细胞中 不表达。以hsc70为靶标，干扰该基因的正确表达，可以降低昆虫的抗逆性，从而达到防治 害虫的目的。 三、
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种灰飞虱热激蛋白LHSC70基因的CDNA序列，其碱 基序列如SEQ1所示。
[0006] 本发明的另一个目的在于基于灰飞虱LHSC70基因的CDNA序列，选择合适的区域 设计特异引物，利用试剂盒进行体外合成dsRNA，双链序列如SEQ2所示。
[0007] 本发明的又一个目的是将合成的dsRNA，喂食灰飞虱，从而致死灰飞虱。有助于利 用生物基因资源达到害虫防治的目的，从而减少化学杀虫剂的使用。
[0008] 本发明的技术方案是，先采用RT-PCR扩增目的基因，然后将该基因导入PEASY-T3 载体，转化大肠杆菌DH5a，扩大培养并测序验证，序列如SEQ1。抽取质粒，并以质粒为模 板，扩增Lhsc70,然后利用体外转录试剂盒体外合成dsRNA，序列如SEQ2。再用体外合成的 dsRNA饲喂灰飞虱。连续饲喂数天后统计试虫死亡情况。 四、
【具体实施方式】
[0009] (1)取30头灰飞虱（包括1-5龄和雌雄成虫），用液氮研磨，然后利用Trizol试 剂盒提取总RNA，反转录成cDNA，-20°C贮存。
[0010] (2)以cDNA为模板，利用RT-PCR扩增Lhsc70序列，将扩增片段连接到PEASY-T3 载体，转化大肠杆菌。然后挑取单克隆测序验证。
[0011] (3)测序验证准确无误后抽取质粒，以质粒为模板扩增Lhsc70序列片段，然后利 用试剂盒进行体外转录成dsRNA。
[0012] (4)测定dsRNA的浓度，配制饲料，在饲料中加入相应浓度的dsRNA，饲喂灰飞虱初 孵若虫和初羽化成虫，每2天更换1次饲料，并检查灰飞虱存活率。
[0013] (5)饲喂4天后，取存活灰飞虱测定其耐热性，同时提取总RNA，检验Lhsc70的表 达量。
[0014] 实施例1 :
[0015] 取1龄灰飞虱，饲喂含终浓度为100ng/y1dsRNA的饲料，4天后灰飞虱死亡率为 22%，饲喂含终浓度为200ng/y1dsRNA的饲料时，4天后死亡率为100%。取初羽化灰飞 虱雌成虫，饲喂含终浓度为100ng/y1dsRNA的饲料，4天后灰飞虱死亡率为60%。死亡率 如附图1。
[0016] 实施例2:
[0017] 取初羽化灰飞虱雌成虫，饲喂含终浓度为100ng/y1dsRNA的饲料，4天后将存活 试虫在42°C处理半小后，室温恢复2小时，取食含dsRNA饲料的雌成虫对温度的耐受性下降 27%，如附图2。 五、
【附图说明】
[0018] 图1、RNAi灰飞虱初孵若虫和雌成虫Lhsc704天后的死亡率。
[0019] 图2、RNAi灰飞虱雌成虫Lhsc70 4天后，存活试虫对温度的耐受性。取食dsRNA 的试虫42°C热激后死亡率更高。（RNAi灰飞虱雌成虫Lhsc70 4天后，42°C热激后的死亡率。 Gfp为荧光蛋白基因，作为对照。如图2所示）。
【主权项】
1. 本发明属于农业生物技术领域，涉及灰飞虱热激蛋白基因 Lhsc70序列，其核酸序列 如SEQl所示。
2. 基于权利要求1中Lhsc70的序列，利用体外转录试剂盒合成该序列的dsRNA，序列 如SEQ2所示。利用该dsRNA饲喂灰飞虱后，其对温度的抗逆性下降，死亡率增加。
【专利摘要】本发明涉及灰飞虱热激蛋白基因Lhsc70和针对该基因的dsRNA片段及其对灰飞虱的杀虫活性，属于生物技术领域。灰飞虱Lhsc70的cDNA序列如SEQ1，由RT-PCR扩增获得。针对该序列，设计特异性引物扩增Lhsc70部分序列，继而以此为模板体外转录获得dsRNA如SEQ2。以该dsRNA饲喂灰飞虱后显著降低其对温度的抗逆性，增加其死亡率，表现出一定的杀虫活性。
【IPC分类】A01N57-16, C12N15-113, A01P7-04, C12N15-12
【公开号】CN104651370
【申请号】CN201410763463
【发明人】王利华, 罗光华, 单丹, 姚静, 张月亮, 方继朝
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月9日