专利名称：一种用于快速鉴定蛋白质及其n端序列的新方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的测序方法。具体的说，涉及蛋白质N端序列的质谱测定方法。本发明还涉及用于该方法的试剂盒。
背景技术：
众所周知，蛋白质的N端测序对蛋白质的鉴定及功能分析都非常重要。一方面，蛋白质的N端序列标签具有很高的特异性。据统计，43％至83％的蛋白质具有独特的N端4残基标签(依物种而异)[Wilkins，M.R.，Gasteiger，E.，Tonella，L.，Ou，K.et al，J.Mol.Biol.1998，278，599-608.]。另一方面，蛋白质的N端序列有助于确证蛋白质的N端加工，如信号肽的去除、N端蛋氨酸残基的切除等。目前，最常用的测定蛋白质N端序列的方法是Edman降解法。虽然也可以实现自动化，但它对样品的纯度要求很高，很耗时，方法的通量也很低。
本发明提供了一种简单快速、既可进行蛋白质N端测序，又可同时对其它肽段进行分析以鉴定蛋白质的高通量方法。本发明人发现，通过在蛋白质的N端氨基上引入同系物标记，既有利于在一级质谱图中确定蛋白质的N端肽段，又有利于在二级质谱中区分其y离子和b离子，有利于N端肽段的质谱测序。本发明还涉及用于方便实施本方法的试剂盒。
发明内容
本发明提供了一种简单有效、用于快速测定蛋白质N端序列的新方法和试剂盒。本发明人发现，通过在蛋白质的N端引入同系物标记，既有利于在一级质谱图中确定蛋白质的N端肽段，又有利于在二级质谱中区分其y离子和b离子，有利于N端肽段的质谱测序。具体的说，该方法涉及蛋白质氨基的修饰、还原烷基化和胰酶酶切、酶切肽段的质谱分析、N端肽段的质谱识别与测序，步骤包括(1)对蛋白质的侧链氨基进行修饰，以提高修饰反应的选择性和酶切产生的N端肽段的长度；(2)用一对或多对同系物酰化试剂衍生蛋白质的N端氨基，以引入同系物标记。
(3)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(4)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；(5)用质谱技术确定蛋白质N端肽段，并进行其序列分析。
其特征在于所述步骤(2)的处理方法为
(a)用酸酐类或活化羧酸酯类同系物试剂对蛋白质的末端氨基进行化学修饰，使其带上同系物标记；(b)用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
其中，步骤(a)所述同系物试剂选自乙酸酐/丙酸酐，丁二酸酐/戊二酸酐，乙酸琥珀酰亚胺酯/丙酸琥珀酰亚胺酯，苯甲酸琥珀酰亚胺酯/甲基苯甲酸琥珀酰亚胺酯。
该方法通过在蛋白质的N端氨基上引入同系物标记，使其N端肽在蛋白质的肽质量指纹图中表现为质量数相差14Da的一对双峰，明显区别于非N端肽的单峰，从而可以快速确定蛋白质的N端肽，然后通过质谱技术实现蛋白质的鉴定及N端测序。加在蛋白质N端肽段上的同系物标记，既有利于在一级质谱图中确定N端肽，又有利于在二级质谱图中确定y离子和b离子从而有助于其序列分析。
利用本方法，大大提高了蛋白质N端测序的速度和通量化水平，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图对蛋白质末端肽进行从头测序。
本发明还提供了一种用于快速测定蛋白质N端序列的试剂盒，该试剂盒含有(a)一对或多对可对蛋白质N端氨基进行修饰，使其带上质量标记的同系物试剂对；(b)一种或多种含游离氨基的化学试剂；其中组分(a)所述试剂优选乙酸酐/丙酸酐；组分(b)所述化学试剂优选三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶；侧链氨基保护试剂，如O-甲基异脲；此外还可含有国家行政机关批准的使用说明等。
本发明的新方法和试剂盒适用于蛋白质的鉴定与N端序列的快速测定，适用于生物学、医学、药物学研究和应用领域中蛋白质的鉴定和N端测序，特别适合于基因工程重组产品或药物的N端序列分析及质量控制，与二维电泳技术相结合也适用于对蛋白质进行规模化的N端测序。
本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质研究。
图1.经N端同系物标记后，鸡溶菌酶的肽质量指纹图(质荷比相差14Da的一对峰为N端肽)图2.同系物标记后，鸡溶菌酶N端肽的串联质谱图(#K*VFGR，1-5)图3.经N端同系物标记后，重组人生长激素的肽质量指纹图(质荷比相差14Da的一对峰为N端肽)图4.同系物标记后，重组人生长激素N端肽的串联质谱图(#FPTIPLSR，1-8)具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1鸡溶菌酶的N端测序1.1取0.1mg鸡溶菌酶，溶于0.1mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液(含0.1％SDS)，加入0.1mL 1M pH 12的O-甲基异脲溶液，37℃反应2小时。调pH至8后，加入20mM的乙酸酐和丙酸酐的混合溶液，室温反应1小时，加入100mM pH 8的Tris/HCl终止反应。再加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小时。
1.2质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。将样品与基质溶液(5mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL点在样品靶上，自然挥干后进行质谱分析。用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da。先采集一级质谱图，可见N端肽表现为质荷比相差14Da的一对峰(690.4/704.4)，而其它肽为单峰(见图1)。然后选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图。比较两种标记N端肽的二级质谱图，可见两种N端肽的C端碎片离子(y离子)相同，而N端碎片离子(b离子)质荷比相差14Da(见图2)。
实施例2不同来源的重组人生长激素的N端测序与序列比较2.1取重组人生长激素0.1mg，溶于0.1mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液(含0.1％SDS)，加入0.1mL 1M pH 12的O-甲基异脲溶液，37℃反应2小时。调pH至8后，加入20mM的乙酸酐和丙酸酐的混合溶液，室温反应1小时，加入100mM pH 8的Tris/HCl终止反应。再加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小时。
2.2质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。将样品与基质溶液(5mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL点在样品靶上，自然挥干后进行质谱分析。用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da。先采集一级质谱图，可见N端肽表现为质荷比相差14Da的一对峰(972.6/986.6)，而其它肽为单峰(见图3)。然后选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图。比较两种标记N端肽的二级质谱图，可见两种N端肽的C端碎片离子(y离子)相同，而N端碎片离子(b离子)质荷比相差14Da(见图4)。
权利要求
1.一种用于快速测定蛋白质N端序列的方法，该方法包括(1)对蛋白质的氨基进行化学修饰(2)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(3)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；(4)用质谱分析技术分析蛋白质末端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；其特征在于所述步骤(1)的处理方法为(a)用酸酐类或活化羧酸酯类同系物试剂对蛋白质的末端氨基进行化学修饰，使其带上同系物标记；(b)用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)所述同系物试剂对选自乙酸酐/丙酸酐，丁二酸酐/戊二酸酐，乙酸琥珀酰亚胺酯/丙酸琥珀酰亚胺酯，或苯甲酸琥珀酰亚胺酯/甲基苯甲酸琥珀酰亚胺酯。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)所述化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
4.一种用于快速测定蛋白质N端序列的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(a)一对或多对可对蛋白质N端氨基进行修饰，使其带上质量标记的同系物试剂对；(b)一种或多种含游离氨基的化学试剂；
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于(a)所述同系物试剂对选自乙酸酐/丙酸酐，丁二酸酐/戊二酸酐，乙酸琥珀酰亚胺酯/丙酸琥珀酰亚胺酯，或苯甲酸琥珀酰亚胺酯/甲基苯甲酸琥珀酰亚胺酯。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于(b)所述化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
全文摘要
本发明提供了一种用于快速测定蛋白质N端序列的新方法和试剂盒。该方法涉及蛋白质氨基的修饰、还原烷基化和胰酶酶切、酶切肽段的质谱分析、N端肽段的质谱识别与测序。通过对N端氨基的选择性同系物标记，在质谱上既容易确定N端肽段，又可以很方便地进行测序，主要用于确证蛋白质，尤其是基因工程产品的N端序列。本发明还描述了便于该方法实施的试剂盒。
文档编号G01N1/28GK101055267SQ20061007259
公开日2007年10月17日 申请日期2006年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者钱小红, 周春喜, 刘新, 张养军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所