红豆杉凝集素蛋白编码序列的制作方法

专利名称：红豆杉凝集素蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、以及基因工程领域。特别是一种在红豆杉中表达的凝集素蛋白及其核酸序列。
背景技术：
虫害是造成农作物减产的重要因素之一，害虫不仅对作物产生直接危害，还因携带各种植物病原体而造成间接危害。在全世界范围内，每年因各种虫害造成的直接损失约占农作物总收获量的13％以上Gatehouse et al.，1992)，年损失约数千亿美元。特别是针对同翅目害虫(如蚜虫、褐飞虱及叶蝉等在世界范围内危害都很严重)的抗虫基因很少被分离。因此，分离克隆这类抗性基因以用于分子育种，对于减少病虫危害带来的损失，保证粮食的稳定增产和卫生品质的改善具有重要意义(Kai et al.，2003)。近年来凝集素在生物学方面的应用研究发展迅速，它最大的特点在于其能够识别糖和糖类，每一种凝集素具有对某一种特殊的碳水化合物有专一结合的能力。并已有一些外源凝集素基因如雪花莲外源凝集素(GNA)在提高作物抗同翅目害虫方面体现出了重要的应用价值。
在对现有文献的分析中，虽然“European Journal of Biochemisty(欧洲生物化学杂志)199120223-30”和“DNA sequence(核苷酸序列)，200314223-226”等先后报道了从高等开花植物中分离克隆了单子叶甘露糖结合凝集素基因，但尚未有任何文献报道从低等裸子植物(红豆杉)中分离出单子叶甘露糖结合凝集素基因，今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种红豆杉凝集素蛋白编码序列。使其能够应用在红豆杉中表达的新的tm-Lectin蛋白、编码序列及其在改良植物对病虫害抗性上的，所获得的转基因植物对植物病虫害具有增强的抗性，具有很大的应用价值。
本发明是通过以下技术方案实现的在本发明所分离出的DNA分子包括编码具有红豆杉凝集素蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列。
本发明分离出的红豆杉凝集素蛋白质多肽包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
本发明DNA分子转化的宿主细胞是真核细胞。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中红豆杉凝集素蛋白(或多肽)编码序列指编码具有红豆杉凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第63-497位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第63-497位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第63-497位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。
还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的红豆杉凝集素蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中红豆杉凝集素蛋白或多肽指具有红豆杉凝集素蛋白活性的SEQID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然红豆杉凝集素蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括红豆杉凝集素蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的红豆杉凝集素蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与红豆杉凝集素蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用红豆杉凝集素蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中红豆杉凝集素蛋白保守性变异多肽指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1


表243％identity in 137 aa overlap，59％similarity in 137 aa overlapt.pep1 MGESSVTTAAIVALVILLTFANPCSSKSVLKSGESLAAGESLQYAQYILVMQGDCNLVLY 60M ++S+ A + L ++ + C ++L SGE+L+ GE L Y ++ +MQ DCNLVLYg.pep1 MAKASLLILAAIFLGVITPSSPSCLGDNILYSGETLSTGEFLNYGGFVFIMQEDCNLVLY 60t.pep61 ANKVKVLWASRTNGKGGAASCKLSMQNDGNLVIYA-ATTPVWASRTSRAFASYKLNLQGD 119+ K +WA+ T G + SC LSMQ DGNLV+Y + P+WAS T+YLQ Dg.pep61 -DVDKPIWATNTGGL--SRSCFLSMQTDGNLVVYTPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKD 117t.pep120 GNVVIYGPSGAIWATNT 136NVVIYG WAT Tg.pep118 RNVVIYGTDR--WATGT 132t.pep红豆杉t-lectin蛋白氨基酸序列g.pep雪花莲g-Lectin蛋白氨基酸序列(GenBank Accession No.JE0136)表2为本发明的红豆杉凝集素蛋白与雪花莲凝集素氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明还包括红豆杉凝集素蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然凝集素多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的红豆杉凝集素蛋白多肽时，可以将红豆杉凝集素蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成红豆杉凝集素蛋白表达载体。
如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中宿主细胞为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析红豆杉凝集素蛋白基因产物的表达，即分析红豆杉凝集素蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有红豆杉凝集素蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码红豆杉凝集素蛋白的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在红豆杉凝集素蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于红豆杉凝集素蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的红豆杉凝集素蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选红豆杉凝集素蛋白源基因或同源蛋白。
为了得到与红豆杉凝集素蛋白基因相关的红豆杉cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选红豆杉cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对红豆杉凝集素蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自红豆杉的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与红豆杉凝集素蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本发明的红豆杉凝集素蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的红豆杉凝集素蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与红豆杉凝集素蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。
本发明在抗性试验中具有明显的作用，对保护植物的健康生长有所帮助。我国的农作物在很多地区存在品质差、虫害重的问题，提高农作物的抗性是解决这一问题的有效方法，本发明的凝集素基因正具备这项功能，包括植物的抗虫、抗病以及抗菌等的改良。因此，具有很大的应用价值。
具体实施例方式
下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1红豆杉凝集素蛋白基因的克隆1.组织分离(isolation)红豆杉(品种为“曼地亚”)幼嫩叶片来源于西南师范大学，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。
2.RNA的分离(RNA isolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据雪花莲及其它单子叶甘露糖凝集素氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)3’-RACEPCR(UPM+F2)得到TMF2’(0.5kb)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知单子叶甘露糖凝集素基因(如韭莲和雪花莲凝集素等)的同源性很高，故初步认为它是一个凝集素基因。
(2)5’-RACE根据3’RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到TMR2’(0.4kb)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。将测序结果与3’RACE结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。
(3)将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增TMA编码区(TMAKFi+TMAKR1)得到TMA编码区(0.43kb)(过程同(1))。
BLAST的结果及分子建模结果证明从红豆杉中新得到的基因确为一个植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素(GNA)基因具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(Hilder等，1995；Powell等，1993，1995；)，故推测此基因具有相同的功能。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的红豆杉t-lectin蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物TMAF15’-GGTMATTCTTMATCGCCATTATA-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸TMAR15’-AACGGAAGAAGATTGTATCTTC-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为606bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。
实施例2红豆杉凝集素蛋白基因的序列信息与同源性分析本发明新的红豆杉凝集素全长cDNA的长度为606bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于63-497位核苷酸。根据全长cDNA推导出红豆杉凝集素的氨基酸序列，共144个氨基酸残基，分子量15.166KD，pI为9.48。详细序列见SEQ ID NO.4。
将红豆杉凝集素的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与雪花莲凝集素(GNA)基因存在一定的同源性。在氨基酸水平上，它与雪花莲凝集素(GenBank Accession No.JE0136)的第1-159位氨基酸残基有43％的相同性和59％的相似性(见表2)。由上可见，红豆杉凝集素基因与雪花莲凝集素基因在蛋白水平上存在较高的同源性，故可以认为凝集素在提高植物的抗虫性上也具有相似的作用。
实施例3红豆杉tm-lectin蛋白的结构和功能研究1.红豆杉tm-lectin蛋白的氨基酸序列的前体蛋白和成熟蛋白分析。通过对红豆杉tm-lectin蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比较分析，发现红豆杉tm-lectin蛋白基因编码一前体蛋白含有信号肽序列、成熟蛋白序列，按van Heijne(1986)等预测凝集素蛋白信号肽的规则和对红豆杉tm-lectin蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比较，鉴定出红豆杉tm-lectin蛋白的信号肽剪切位点在第26氨基酸(S)和第27氨基酸(K)之间，该位置也符合目前已知的大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子兰凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的信号肽剪切位点。
2.红豆杉tm-lectin蛋白的专一结合糖基化分析。通过对红豆杉tm-lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等的专一结合糖基化分析，发现红豆杉tm-lectin蛋白同大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等一样，具有3个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)，见下表(表中甘露糖专一结合位点盒QDNY用方框框住)。因此证明红豆杉tm-lectin蛋白也同雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素等一样，为甘露糖专一结合的凝集素蛋白。
1 MGESSVTTAA IVALVILLTF ANPCSSKSVL KSGESLAAGE SLQYAQYILV51 G C LVL ANKVKVLWAS RTNGKGGAAS CKLSM N G LVI AATTPV101 WASRTSRAFA SYKLNL G G VVI GPSGA IWATNTAQNK KKLL实施例4红豆杉凝集素蛋白或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯在该实施例中，将全长的红豆杉tm-Lectin编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
将红豆杉tm-Lectin多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。
原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据红豆杉tm-Lectin的氨基酸序列，设计扩增出切除信号肽后的蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将红豆杉tm-Lectin基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-tm-Lectin表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-lectin。
表达Trx-tm-Lectin重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-tm-lectin工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-tm-lectin融合蛋白的工程菌。
Trx-tm-Lectin融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达Trx-tm-lectin融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-lectin，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH 11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集Trx-tm-Lectin融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获的tm-lectin的表达蛋白。
实施例5红豆杉凝集素蛋白或多肽在烟草中进行真核细胞表达及转基因植株的抗虫性鉴定含目的基因(红豆杉凝集素蛋白基因)的表达载体的构建，根据红豆杉凝集素蛋白的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将红豆杉凝集素蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。
利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
利用Western blot检测TMA蛋白在转基因烟草植株中的表达1.蛋白的提取a)取50mg叶片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml Eppendorf管中研磨；b)13000rpm，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注以上过程于冰上进行。
2.蛋白的定量参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入1ml Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595；蛋白含量计算10D595＝28.57μg。
3.SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加样前，将样品置于含50mmol/L DTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.8 1ml；溴酚兰0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分钟；b)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。
4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；5.膜上蛋白的检测a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g叠氮钠)；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗红豆杉ca-Lectin的抗体)，37℃温育30分钟；d)同步骤b，洗涤三次；e)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；f)加入底物显色观察蛋白条带。
含红豆杉凝集素基因(TMA)的转基因植株的抗虫性鉴定鉴于编码甘露糖专一结合的植物凝集素如雪花莲凝集素(GNA)的基因已被证明对病虫害如刺吸式口器类昆虫如蚜虫(Hilder等，Transgenic Res，1995，418～25)、飞虱(Tang等，Plant Breeding，2002，12193～95)及咀嚼式口器类昆虫如番茄蛾Lahanohia olerucea(Gatehouse等，Molecular Breeding，1997，349～63)都具有抗性，而红豆杉凝集素(TMA)也为甘露糖专一结合的凝集素且与雪花莲凝集素(GNA)具有较高的同源性，因此编码红豆杉凝集素的基因(TMA)同雪花莲凝集素基因(gna)相似，也应具有抗虫功能。我们进一步对表达红豆杉凝集素基因(TMA)的转基因植株进行抗虫性鉴定。按Hilder等(Transgenic Res，1995，418～25)的方法对表达红豆杉凝集素基因(TMA)的转基因烟草植株(20-30厘米高)进行蚜虫(桃蚜)抗性鉴定，研究其对蚜虫存活率和发育进度的影响。对蚜虫存活率的研究中，在每株植株上接种10头蚜虫一龄若虫后每2天测定蚜虫存活数(共测定14天)。对蚜虫发育进度的研究中，在每株植株上接种5头蚜虫一龄若虫，13天后测定存活的蚜虫成虫数和若虫数。结果表明，在表达红豆杉凝集素基因(TMA)的转基因烟草植株上存活的蚜虫数量同非转基因对照上的相比显著减少(P＜0.05)，同时，在表达红豆杉凝集素基因(TMA)的转基因烟草植株上存活的蚜虫其发育进度同非转基因对照上的相比也被显著减缓(P＜0.05)，其13天后发育成成虫的数量也显著减少(P＜0.05)。因此抗虫性结果证明，红豆杉凝集素基因(TMA)对昆虫(如蚜虫)确有抗性，红豆杉凝集素基因(TMA)可用于利用转基因技术控制植物虫害的研究和产业化中。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GGCAATTCTCAATCGCCATTATA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2AACGGAAGAAGATTGTATCTTC(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)长度606bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3
<110>上海交通大学<120>红豆杉凝集素蛋白编码序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>676<212>DNA<213>红豆杉(Taxus median)<220>
<221>CDS<222>(63)..(497)<223>
<400>1ggcaattctc aatcgccatt atatcagatc agcagcttag cctcgctaac agatcaaaca60ta atg gga gaa tca tct gta act aca gcc gcc att gta gcg ctg gta 107Met Gly Glu Ser Ser Val Thr Thr Ala Ala Ile Val Ala Leu Val1 5 10 15ata tta ctt acg ttt gca aat cct tgc tca tca aaa tct gtt ctc aaa 155Ile Leu Leu Thr Phe Ala Asn Pro Cys Ser Ser Lys Ser Val Leu Lys20 25 30agc ggg gaa tca ctg gcg gct gga gag tct ctg caa tac gct caa tat 203Ser Gly Glu Ser Leu Ala Ala Gly Glu Ser Leu Gln Tyr Ala Gln Tyr35 40 45ata ttg gta atg caa ggc gac tgc aac ctg gtt ttg tat gca aac aag 251
Ile Leu Val Met Gln Gly Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asn Lys50 55 60gtg aaa gtg ttg tgg gcg tca agg aca aat gga aaa ggc ggc gcc gcc 299Val Lys Val Leu Trp Ala Ser Arg Thr Asn Gly Lys Gly Gly Ala Ala65 70 75tcc tgc aag ttg agt atg cag aat gac ggc aat ttg gtg ata tat gcg 347Ser Cys Lys Leu Ser Met Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Ala80 85 90 95gcg acc aca cct gta tgg gct agt aga acc tcc aga gcc ttt gct tcc 395Ala Thr Thr Pro Val Trp Ala Ser Arg Thr Ser Arg Ala Phe Ala Ser100 105 110tac aag ctc aat ctt cag ggc gat ggt aat gtt gtt att tat ggg ccg 443Tyr Lys Leu Asn Leu Gln Gly Asp Gly Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro115 120 125tct gga gct att tgg gct act aat aca gct cag aac aag aaa aaa ctt 491Ser Gly Ala Ile Trp Ala Thr Asn Thr Ala Gln Asn Lys Lys Lys Leu130 135 140ctc tga actttctggt gggggaactt gttttttaga tactacagga gttaacgatc547Leucagtaacttg gcacacttct tgacgtgtta ataataggaa gatacaatct tcttccgtta 607aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 667aaaaaaaaa 676
<210>2<211>144<212>PRT<213>红豆杉(Taxus median)<400>2Met Gly Glu Ser Ser Val Thr Thr Ala Ala Ile Val Ala Leu Val Ile1 5 10 15Leu Leu Thr Phe Ala Asn Pro Cys Ser Ser Lys Ser Val Leu Lys Ser20 25 30Gly Glu Ser Leu Ala Ala Gly Glu Ser Leu Gln Tyr Ala Gln Tyr Ile35 40 45Leu Val Met Gln Gly Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asn Lys Val50 55 60Lys Val Leu Trp Ala Ser Arg Thr Asn Gly Lys Gly Gly Ala Ala Ser65 70 75 80Cys Lys Leu Ser Met Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Ala Ala85 90 95Thr Thr Pro Val Trp Ala Ser Arg Thr Ser Arg Ala Phe Ala Ser Tyr100 105 110Lys Leu Asn Leu Gln Gly Asp Gly Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro Ser115 120 125Gly Ala Ile Trp Ala Thr Asn Thr Ala Gln Asn Lys Lys Lys Leu Leu130 135 140
权利要求
1.一种红豆杉凝集素蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子包括编码具有红豆杉凝集素蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的红豆杉凝集素蛋白编码序列，其特征是，分离出的红豆杉凝集素蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的红豆杉凝集素蛋白编码序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第63-497位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的红豆杉凝集素蛋白编码序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的红豆杉凝集素蛋白编码序列，其特征是，所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种红豆杉凝集素蛋白编码序列，用于生物、基因工程领域。所分离出的DNA分子包括编码具有红豆杉凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63－497位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第63－497位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗虫中具有明显的作用，本发明具有很大的应用价值。
文档编号C07K14/415GK1560250SQ200410016709
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月4日 优先权日2004年3月4日
发明者唐克轩, 开国银, 苗志奇, 李柱刚, 赵凌侠 申请人:上海交通大学