专利名称：一种新的人蛋白及其编码序列,以及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人Py-CR的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白是人吡咯啉-5’-羧酸还原酶(pyrroline-5′-carboxylate reductase，简称为“P5CR”)(EC1.5.1.2)的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
吡咯啉-5’-羧酸还原酶(pyrroline-5′-carboxylate reductase，简称为“P5CR”)(EC1.5.1.2)是一个分布极为广泛的酶，普遍存在于各种原核生物和真核动植物中。它专一地催化依赖NAD(P)H的、将吡咯啉-5’-羧酸转变为脯氨酸的还原反应，并将NAD(P)H氧化NAD(P)+。其反应一般可表示为吡咯啉-5’-羧酸+NAD(P)H→脯氨酸+NAD(P)+在不同的生物体的不同组织中，P5CR发挥着不同的生理功能。在成纤维细胞、软骨和其它大量需要脯氨酸的组织中，P5CR的主要作用是生成脯氨酸，参与蛋白质合成(Metabolism 1978，27685-694)；而在红细胞中，P5CR参与反应产生NAD(P)+作为6-磷酸葡萄糖脱氢酶的辅酶，从而刺激磷酸己糖支路的活化(Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，852036-2040)；在耐受干旱或高盐等环境压力的植物中，它产生脯氨酸作为一种有效的渗压剂(Plant Cell.Physiol.1997，38(10)1095-1102)；另外，它也可以是细胞内氧化还原势能的调节者，因此P5CR具有重要的生物学意义。
早在八十年代，人们就从牛角膜、大鼠晶状体、人红细胞等不同来源中分离得到了P5CR的蛋白分子(Biochim.Biophys.Acta 1982，717215-219；Biochim.Biophys.Acta 1986，88172-78；J.Biol.Chem.1989，264(16)9352-9358)。1982年，Deutch等人最先获得大肠杆菌P5CR的DNA序列(Nucleic Acid Res.1982，107701-7714)。1990年，Delauney等人通过功能互补实验克隆了大豆的P5CR基因(Mol.Gen.Genet.1990，221299-305)。1992年，Dougherty小组从人肝细胞株来源的cDNA文库中克隆了第一个人P5CR cDNA(J.Biol.Chem.1992.267(2)871-875)。以后，人们又在热细菌、真菌、昆虫和植物中发现了编码P5CR的基因。
然而，迄今为止，尚未见有与本发明序列一致的报道。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码吡咯啉-5’-羧酸还原酶(pyrroline-5′-carboxylate reductase，简称为“P5CR”)同系物的一个新成员，本发明的P5CR同系物成员被命名为人Py-CR。
本发明的另一个目的是提供一种新的人的P5CR同系物成员，该蛋白被命名为人Py-CR蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的Py-CR多肽的方法。
本发明还提供了这种人的Py-CR核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人Py-CR蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人Py-CR蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Py-CR蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Py-CR蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Py-CR蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Py-CR蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1121个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于136-1098位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人Py-CR蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人PY-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中136-1098位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框136-1098位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中136-1098位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人Py-CR相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人Py-CR蛋白多肽”指具有人Py-CR蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人Py-CR蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人Py-CR蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人Py-CR DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人Py-CR多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人Py-CR多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人Py-CR多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人Py-CR多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人Py-CR蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人Py-CR多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人Py-CR保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表
本发明还包括人Py-CR多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人Py-CR的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人Py-CR多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人Py-CR的核酸分子。
本发明还包括检测人Py-CR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人Py-CR多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人Py-CR DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多范隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Py-CR基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Py-CR基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人Py-CR蛋白的分子，也包括那些并不影响人Py-CR蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人Py-CR基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Py-CR基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Py-CR或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人Py-CR功能的抗体以及不影响人Py-CR功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人Py-CR基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Py-CR基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得，本发明的人Py-CR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施例中，人Py-CR的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人肝λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A5’-CAGAAGCTGCTGTTAGCTCGCCG-3′为正向引物，寡核苷酸B5′-TCACAGAGGGGACAGATGCTGCC-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
吡咯啉-5’-羧酸还原酶是脯氨酸合成中最后一步反应的催化者，以NADPH或NADH为辅酶，促进吡咯啉-5’-羧酸还原成脯氨酸，同时氧化NAD(P)H为NAD(P)+。它具有重要的生物学功能，在脯氨酸的内源生成，调节细胞氧化—还原势能，活化磷酸己糖支路，维持细胞渗透压，参与能量从固氮植物向其内共生体转换等各种生理过程中都有重要的作用。吡咯啉-5’-羧酸还原酶的类似物很可能也在类似途径中发挥着重要作用。
在附图中，
图1为本发明的人Py-CR与人吡咯啉-5’-羧酸还原酶(P5CR)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人Py-CR的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人肝λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A5’-CAGAAGCTGCTGTTAGCTCGCCG-3’(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸B5’-TCACAGAGGGGACAGATGCTGCC-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到约1.1kb的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A/B与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1121bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于136-1098位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人Py-CR的氨基酸序列，共320个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用本发明的人Py-CR的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它们与不同来源的P5CR基因及其编码蛋白，如人P5CR(M77836)、大豆P5CR(X16352)和Actinidia deliciosa P5CR(U92287)，具有广泛的同源性。是用PCGENE软件比较发现它与人P5CR在蛋白水平上的同一性达到84％，另有6.6％的氨基酸相似，因此，本发明的人Py-CR蛋白可归人P5CR蛋白同系物，并且可以推测它具有P5CR蛋白同系物的一般功能。
吡咯啉-5’-羧酸还原酶分布极为广泛，在细菌、真菌、昆虫、哺乳动物、植物等各种生物体内都有表达。它是脯氨酸合成中最后一步反应的催化者，以NADPH或NADH为辅酶，促进吡咯啉-5’-羧酸还原成脯氨酸，同时氧化NAD(P)H为NAD(P)+。它具有重要的生物学功能，在脯氨酸的内源生成，调节细胞氧化—还原势能，活化磷酸己糖支路，维持细胞渗透压，参与能量从固氮植物向其内共生体转换等各种生理过程中都有重要的作用。不同来源的P5CR由于起不同的生理功能，表现出的底物亲和力、辅酶需求以及产物抑制作用有所不同。
在动物体中，脯氨酸是合成胶原蛋白的主要原料，因此在像软骨、骨骼、眼等大量需要脯氨酸的组织中，P5CR的表达水平特别高，它的主要作用就是还原吡咯啉-5’-羧酸，生成脯氨酸(Metabolism 1978，27685-694)，并且以NADH为辅酶时具有更高的反应速率，并受到产物脯氨酸的抑制调节。此外，P5CR在红细胞也有表达，特别是它在脯氨酸合成缺陷的淋巴母细胞中也有功能(Biochem.Biophys.Res.Commun.1981，101(3)1018-1025)，提示它的另一个重要作用产生NADP+，调节细胞内的氧化还原势能，激活糖代谢的另一个重要途径——磷酸己糖支路(HMP支路)。HMP支路在各种生物中都存在，它可以循环分解六碳糖产生NADPH，为脂肪酸、固醇等物质的合成代谢提供必须的能量来源，是乳腺、脂肪组织、肾上腺皮质等组织中主要的葡萄糖分解途径。并且，HPM支路和植物光合作用共有一些酶和中间产物，关系十分密切，它在植物中的存在更普遍。吡咯啉-5’-羧酸和脯氨酸可以作为一对氧化还原对，提供一种氧化还原势能的往返机制(Curr.Top Cell Reg.1985，2591-132)。P5CR作用于此时，表现出不受产物脯氨酸而受NADP+和ATP的抑制调节。
尽管目前还没有发现P5CR异常引起的遗传疾病，但是根据其重要的生理功能，可以预测P5CR的缺陷，可以导致矮小症、软骨发育异常、白内障、泌乳障碍、溶血性贫血等疾患(J.Biol.Chem.1992，267(2)871-875)。在一种先天性渗透白内障的小鼠(Nakano小鼠)晶状体中，HMP支路水平一贯低于对照组水平(Exp.Eye Res.1985，41767-775)。Py-CR的缺陷可能也会导致类似的疾病。
本发明的人Py-CR除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人Py-CR还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人Py-CR的N端与人P5CR的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人Py-CR的抗体，用于筛选该家族的其他成员(如P5CR的其他类似物)，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人Py-CR核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人Py-CR的表达水平或者抑制人Py-CR的过度表达。本发明的人Py-CR蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人Py-CR缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人Py-CR在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人Py-CR的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)进行扩增，获得人Py-CR cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGGTCGACATGAGCGTGGGCTTCATCG-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人Py-CR编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TTGGAAGCTTTTAGTCCTTCTTGCCTCCC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人Py-CR的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人Py-CR的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人Py-CR。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人Py-CR。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约34KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人Py-CR在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人Py-CR的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)进行扩增，获得人Py-CR cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGAAGCTTATGAGCGTGGGCTTCATCG-3′(SEQ ID NO.7)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人Py-CR编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TTGGGAATTCTTAGTCCTTCTTGCCTCCC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人Py-CR的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用XbaI酶切及测序验证人Py-CR的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTrisáHCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTrisáHCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为34KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人Py-CR基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称一种新的人蛋白及其编码序列，以及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CAGAAGCTGC TGTTAGCTCG CCG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TCACAGAGGG GACAGATGCT GCC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)长度1121bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.3CAGAAGCTGC TGTTAGCTCG CCGGTCCTCG GACGCCGCCC GTTCGCCCCT GCGCTGTCCG 60CCCTTCCCCT AGCGTTACTT CCGGTCCCTC GCTGAGGGGG TTCGTGCGGC TCCCAGGAGG 120CGTGAACCGC GGACCATGAG CGTGGGCTTC ATCGGGGCCG GCCAGCTGGC TAATGCTCTG 180GCGCGGGGCT TCACGGCCGC AGGCATCCTG TCGGCTCACA AGATAATAGC CAGCTCCCCA 240GAAATGAACC TGCCCACGGT GTCCGCGCTC AGGAAGATGG GTGTGAACCT GACACGCAGC 300AACAAGGAGA CGGTGAAGCA CAGCGACGTC CTGTTTCTGG CTGTGAAGCA CATTATCATC 360CCCTTCATCC TGGATGAGAT TGGGGCCGAC GTGCAAGCCA GACACATCGT GGTCTCCTGT 420GCGGCTGGTG TCACCATCAG CTCTGTGGAG AAGAAGCTGA TGGCATTCCA GCCAGCCCCC 480AAAGTGATTC GCTGCATGAC CAACACACCT GTGGTAGTGC AGGAAGGCGC TACAGTGTAC 540GCCACGGGCA CCCATGCCCT GGTGGAGGAT GGGCAGCTCC TGGAGCAGCT CATGAGCAGC 600GTGGGCTTCT GCACTGAGGT GGAAGAGGAC CTCATCGATG CCGTCACGGG GCTCAGTGGC 660AGCGGGCCTG CCTATGCATT CATGGCTCTG GACGCATTGG CTGATGGTGG GGTGAAGATG 720GGTTTGCCAC GGCGCCTGGC AATCCAACTC GGGGCCCAGG CTTTGCTGGG AGCTGCCAAG 780ATGCTGCTGG ACTCGGAGCA GCATCCATGC CAGCTTAAGG ACAATGTCTG CTCCCCTGGG 840GGAGCCACCA TCCACGCCCT GCACTTTCTA GAGAGTGGGG GCTTCCGCTC TCTGCTCATC 900AATGCAGTTG AGGCCTCCTG TATCCGAACA CGAGAGCTAC AGTCCATGGC CGACCAAGAA 960AAGATCTCCC CAGCTGCCCT TAAGAAGACC CTCTTAGACA GAGTGAAGCT GGAATCCCCC 1020ACAGTCTCCA CACTGACCCC CTCCAGCCCA GGGAAGCTCC TCACAAGAAG CCTGGCCCTG 1080GGAGGCAAGA AGGACTAAGG CAGCATCTGT CCCCTCTGTG A(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度320个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ser Val Gly Phe Ile Gly Ala Gly Gln Leu Ala Asn Ala Leu 15Ala Arg Gly Phe Thr Ala Ala Gly Ile Leu Ser Ala His Lys Ile 30Ile Ala Ser Ser Pro Glu Met Asn Leu Pro Thr Val Ser Ala Leu 45Arg Lys Met Gly Val Asn Leu Thr Arg Ser Asn Lys Glu Thr Val 60Lys His Ser Asp Val Leu Phe Leu Ala Val Lys His Ile Ile Ile 75Pro Phe Ile Leu Asp Glu Ile Gly Ala Asp Val Gln Ala Arg His 90Ile Val Val Ser Cys Ala Ala Gly Val Thr Ile Ser Ser Val Glu 105Lys Lys Leu Met Ala Phe Gln Pro Ala Pro Lys Val Ile Arg Cys 120Met Thr Asn Thr Pro Val Val Val Gln Glu Gly Ala Thr Val Tyr 135Ala Thr Gly Thr His Ala Leu Val Glu Asp Gly Gln Leu Leu Glu 150Gln Leu Met Ser Ser Val Gly Phe Cys Thr Glu Val Glu Glu Asp 165Leu Ile Asp Ala Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Pro Ala Tyr 180Ala Phe Met Ala Leu Asp Ala Leu Ala Asp Gly Gly Val Lys Met 195Gly Leu Pro Arg Arg Leu Ala Ile Gln Leu Gly Ala Gln Ala Leu 210Leu Gly Ala Ala Lys Met Leu Leu Asp Ser Glu Gln His Pro Cys 225Gln Leu Lys Asp Asn Val Cys Ser Pro Gly Gly Ala Thr Ile His 240Ala Leu His Phe Leu Glu Ser Gly Gly Phe Arg Ser Leu Leu Ile 255Asn Ala Val Glu Ala Ser Cys Ile Arg Thr Arg Glu Leu Gln Ser 270Met Ala Asp Gln Glu Lys Ile Ser Pro Ala Ala Leu Lys Lys Thr 285Leu Leu Asp Arg Val Lys Leu Glu Ser Pro Thr Val Ser Thr Leu 300Thr Pro Ser Ser Pro Gly Lys Leu Leu Thr Arg Ser Leu Ala Leu 315Gly Gly Lys Lys Asp(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGAGCGTGG GCTTCATCG 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TTAGTCCTTC TTGCCTCCC 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGAGCGTGG GCTTCATCG 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TTAGTCCTTC TTGCCTCCC 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列。
4.一种分离的人Py-CR蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.一种产生具有人Py-CR蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Py-CR蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Py-CR蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Py-CR蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Py-CR蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求4所述的人Py-CR蛋白多肽特异性结合的抗体。
10.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人基因核苷酸序列,更具体地,本发明提供了人Py－CR的cDNA序列,该cDNA编码的蛋白是人吡咯林－5'－羧酸还原酶(pyrroline－5'－carboxylate reductase,简称为“P5CR”)(EC1.5.1.2)的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07H21/00GK1274728SQ9910707
公开日2000年11月29日 申请日期1999年5月25日 优先权日1999年5月25日
发明者余龙, 傅强, 张宏来, 赵勇, 赵寿元 申请人:复旦大学