一种dbat突变酶r363h及其应用
【技术领域】
[00011本发明属于生物分子催化领域，特别涉及一种DBAT酶（10-去乙酰基巴卡亭II1-10 β乙酰基转移酶)突变酶R363H及其应用。
【背景技术】
[0002] 定制酶一直是生物化学家奋斗的目标。随着分子生物学技术的逐渐成熟，对蛋白 序列进行任意修改，可以解读酶的催化机理并继续理性设计酶。这种理性设计可以是增加 已有酶的性质，甚至是重新设计一个蛋白质。
[0003] 高催化活性酶是在生物产业中发挥重要潜能的关键所在，也是现代蛋白质工程研 究的主攻方向。新型催化剂的理性设计往往会拓展我们对蛋白生化特性的认识，尤其是那 些错误少、时间使用合理的蛋白质理性改造过程。目前已利用理性设计突变位点技术对天 然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性以及改进酶的别构效应等进行了成 功的改造 (Kries et al. ,2013)。然而，理性设计方法仅适用于三维结构清楚、结构和功能 的相互关系也较清楚的酶。
[0004] 目前理性设计的思路仍然主要是由Hell inga和Richards于1991年提出的给蛋白 增加新的结合位点的观点。实际操作中，第一步在蛋白分子内引入新的功能域，第二步再进 行优化（Feldmeier et al.，2013;Koga et al. ,2012)。
[0005] 酶活性中心是酶催化的核心部位，其特定的构象不仅有助于底物结合，还能促进 高效的催化作用。因此对酶活性位点改造相较整体蛋白质的改造能更为直接，更为显著的 提升酶的催化活性(Kiss et al.，2013)。但是，酶的活性中心需要十分精确的构象调节，它 既需要一定的柔性去识别底物，完成催化反应，又需要一定的刚性维持合理的构象，来保持 良好的生物学活性;酶的活性中心保持着柔性与刚性间的微妙平衡，随意对活性中心的突 变，会导致酶的迅速失稳或者失活(Hilvert，2013)。
[0006] 随着学者们对酶结构与功能关系认知的逐步完善，计算生物学的迅猛发展，利用 计算机辅助设计进化酶学性质的方法也日趋成熟。利用计算机模拟的方法，可以快速鉴定 与催化直接相关的不可突变的氨基酸和有可能提升酶活性的靶标位点，为蛋白质工程改造 提供快速的指导。
[0007] 本发明通过合成生物学的手段，研究10-去乙酰巴卡亭m乙酰基转移酶的底物拓 展和理性设计新酶，建立合成巴卡亭m的新方法。本发明能通过高效制备巴卡亭m从而极 大的改善紫杉醇供不应求的现状。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的首要在于提供一种DBAT突变酶 R363H。该DBAT突变酶R363H比野生型DBA!1酶具有更高的催化效率。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述DBAT突变酶R363H的应用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 本发明提供一种DBAT突变酶R363H，是氨基酸序列为SEQ ID如:2的0841'酶的第 363位氨基酸由精氨酸(Arg)变为组氨酸(His)。
[0012] 上述DBAT突变酶R363H的氨基酸序列为SEQIDN0:14，其编码基因的核苷酸序列 为SEQ ID N0:13。
[0013] 本发明另一方面涉及携带具有编码序列为SEQ ID NO:13的DBAT突变酶R363H基因 的重组质粒，所述的重组质粒为PET-R363H。
[0014] 本发明还涉及一种工程菌株，其携带上述重组质粒。
[0015] 所述的工程菌株为重组表达菌株TBL21-R363H，即重组质粒转化进宿主大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21 所得。
[0016] 所述的DBAT突变酶R363H在催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的应用。以乙酰辅酶A为酰 基供体时，该DBAT突变酶R363H比DBA!1酶的催化效率提高了 12倍。
[0017] 以酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6或酰基供 体7为酰基供体时，所述的DBAT突变酶R363H比DBA! 1酶具有更高的催化效率。
[0018] 所述的酰基供体1为乙酸乙烯酯;所述的酰基供体2为乙酸丁酯;所述的酰基供体3 为乙酸异丁酯;所述的酰基供体4为乙酸仲丁酯;所述的酰基供体5为乙酸戊酯;所述的酰基 供体6为乙酸异戊酯;所述的酰基供体7为乙酸异丙烯酯。
[0019] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0020] 本发明运用同源建模，分子对接的计算机辅助技术，对DBAT酶进行理性设计，成功 构建出突变酶R363H。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了 12倍，大 大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭m的产量。同时，为降低生产成本，本发明寻找 了 7种新型酰基供体，突变酶均能高效利用这些酰基供体，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高 了 100倍，能作为替代乙酰辅酶A成为合成底物用于制备巴卡亭ΙΠ 。迄今为止，在生物合成巴 卡亭m的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。
【附图说明】
[0021] 图1是各突变酶的SDS-PAGE结果。
[0022] 图2是各突变酶纯化后的SDS-PAGE结果。
[0023]图3是突变酶D166H催化不同浓度酰基供体1、5、7产生巴卡亭ΙΠ 的结果。
[0024]图4是突变酶R363H催化不同浓度酰基供体1、7产生巴卡亭ΙΠ 的结果。
[0025] 图5是突变酶D166HR363H(简称DHRH)催化不同浓度酰基供体1、6、7产生巴卡亭ΙΠ 的结果。
[0026] 图6是DHRH、R363H和D166H分别相对野生型DBAT在利用酰基供体1、2、3、4、5、6上的 效率对比图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0028]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0029] 实施例1野生型DBAT的获得
[0030] 在NCBI上公布的DBAT酶的基因序列SEQ ID N0:l(GenBank:JQ029678.1)，在其起 始密码子ATG前增加 GGAATTC(EcoRI酶切位点），在其终止密码子TGA后增加 GCGGCCGCTTTA (Not I酶切位点），获得带有酶切位点的DBA!1酶的基因序列。
[0031] 用限制性内切酶EcoRI和NotI(Invitrogen公司）对DBA!1酶的基因进行双酶切；同 时，用限制性内切酶EcoRI和Notl对pET-32a( + )载体(Invitrogen公司）进行双酶切。使用凝 胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶（Invitrogen公司）将上述两个酶切产物 连接。将连接产物转化入E.coli DH5a感受态细胞（Invitrogen公司）中，质粒小量提取，酶 切鉴定，PCR(引物是dbat-F和dbat-R)鉴定后送测序确定表达载体构建成功，命名为pET-DBAT。重组质粒转化E·co 1 i BL21 (Invitrogen公司），获得重组表达菌株TBL21-DBAT。所述 DBAT的氨基酸序列为SEQ ID N0:2(GenBank:AFD32413.1)。
[0032] dbat-F: 5' -GGAATTCATGGCAGGCTCAACAGAAT-37 ;(下划线为EcoRI酶切位点）
[0033] dbat-R：57 -ATTTGCGGCCGCTCAAGGTTTAGTTA-37 ;(下划线为Notl酶切位点）
[0034] 实施例2DBAT突变酶的获得
[0035](一)利用全质粒PCR方法构建突变酶载体 [0036] 1、重组质粒pET-DBAT的质粒小量提取；
[0037] 2、以质粒pET-DBAT为模板，结合两端突变引物，利用重叠延伸PCR技术，扩增出含 有突变位点的dbat质粒，PCR体系如下：
[0038]
[0039] 所述的Primer-F和Primer-R需要根据不同的突变酶进行相应的变化，具体如表1 所示。
[0040] 引物对D166AF和D166AR用于获得DBAT突变酶D166A，其氨基酸序列为SEQ ID N0: 4,编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0041 ] 引物对D166HF和D166HR用于获得DBAT突变酶D166H或D166HR363H;DBAT突变酶 D166H的氨基酸序列为SEQ ID N0:6,编码核苷酸序列为SEQ ID N0:5;DBAT突变酶 D166HR363H的氨基酸序列为SEQ ID N0:8,编码核苷酸序列为SEQ ID N0:7。
[0042] 引物对H162AF和H162AR用于获得DBAT突变酶H162A或H162AR363H;DBAT突变酶 H162A的氨基酸序列为SEQIDN0:10，编码核苷酸序列为SEQIDN0:9;DBAT突变酶 H162AR363H的氨基酸序列为SEQ ID N0:12,编码核苷酸序列为SEQ ID N0:11。
[0043] 引物对R363HF和R363HR用于获得DBAT突变酶R363H或D166HR363H;DBAT突变酶 R363H的氨基酸序列为SEQIDN0:14，编码核苷酸序列为SEQIDN0:13 ;DBAT突变酶 D166HR363H的氨基酸序列为SEQ ID N0:8,编码核苷酸序列为SEQ ID N0:7。
[0044] PCR扩增程序:预变性98 °C 3min;循环设定:变性98 °C 15s，退火56 °C 15s，延伸72 °C 8min，20个循环;最后延伸：72°C 10min;反应完成后，利用E.Z.N,A