蓝蛋白质在酸性条 件下结合时，染色液的最大吸光值波长由465nm转移至595nm，同时其颜色由褐色转为蓝色。 通过测定样品的吸光值并对照标准蛋白的吸光值，推算出蛋白浓度。
[0090] (1)考马斯亮蓝溶液的配制
[0091] 称取50mg考马斯亮兰G250完全溶于50mL乙醇（95%)至完全溶解，加入100mLH3P〇4 (85%)，加入蒸馏水至1L，4°C搅拌过夜，滤纸过滤后棕色瓶避光保存于4°C备用。
[0092] (2)牛血清白蛋白（BSA)标准曲线
[0093]以BSA作为标准蛋白绘制标准曲线。配制1 Omg/mL BSA溶液，分别吸取0、0.1、0.5、 0.75、1.0、1.25、1.5、211^并加水补足至1011^，得到浓度为0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、 2mg/mL的BSA溶液，各吸取500yL后分别加入2.5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀后室温下静置 5min，在595nm处测定吸光度值，读数在3~5min内保持稳定。得到的BSA标准曲线。
[0094]由实验数据进行线性拟合，得到曲线方程:Y = 0.1514X-0.0158, R2 = 0.9946。测定 时待测蛋白液浓度需在〇. 1~2mg/mL范围内。
[0095] 2、酶活测定（以野生型为准）
[0096] (1)重组酶催化体系设置
[0097] DBAT酶活力单位定义：在30°C条件下，每分钟转化lyM 10-DBA生成巴卡亭ΙΠ 的所 需的酶量定义为1U。
[0098] 根据不同目的改变体系内的变量，一般体系设置为：
[0099] Mg2+lmM，10-DAB 400μΜ，乙酰辅酶Α 400μΜ，纯化后重组酶 10yL，Buffer定容至400μ L〇
[0100] (2)测定巴卡亭m生成量
[0101] 加样后，轻轻震荡混匀。30°C下反应lh。反应结束后，立即加入400yL乙腈终止反 应。0.22μπι微孔滤膜过滤样品，进行HPLC-UV检测。
[0102] 3、HPLC-UC测定巴卡亭m(以野生酶为准）
[0103] (1 )HPLC条件:采用HPLC-UV对巴卡亭ΙΠ 和10-DAB进行定性、定量，主要参数如下： 柱温:室温;检测波长:227nm;流动相:MeCN: H20(50:50);流速：1. OmL/min;进样量:20yL。
[0104] (2)标准品溶液的制备:分别准确称量巴卡亭m和1 ο-DBA标准品适量，甲醇溶解， 均配置成lmg/mL母液。
[0105] (3)样品溶液的制备：催化反应完成后，加入等体积乙腈，摇匀，终止反应。再用 0.45μπι微孔滤膜过滤，取滤液，即可。
[0106] (4)标准曲线:精密吸取巴卡亭m标准品母液2.5yL、5yL、1 OyL、15yL、20yL，用色谱 级甲醇定容至10mL。过滤后，分别按上述色谱条件测定，重复测定3次，取平均值。以标准品 巴卡亭m的进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并对所测得的 数据进行线性回归分析。
[0107] 同理绘制10-DAB标准曲线。
[0108] (5)精密度的考察:取巴卡亭m标准品溶液，精密吸取20yL连续进样5次，分别按上 述色谱条件进行检测，考察方法的精密度。
[0109] (6)加样回收率:精密称量己知含量的样品，适量加入巴卡亭m对照品，制备供试 品溶液，分别按上述色谱条件及测定方法进行测定，按下列公式计算回收率：
[0110] 巴卡亭ΓΠ 的加样回收率= 加入的巴卡苧ΙΠ 量
[0111]结果与分析：
[0112] 由图1可知，野生型DBAT在发生氨基酸替换后对其可溶性表达及表达量有影响。在 相同的浓度IPTG诱导后，所有突变体仍能够正常表达。其中，D166A和H162AR363H(简写为 HARH)的可溶表达量均减少。相反的是，D166H、R363H和D166HR363H(简写为DHRH)可溶表达 量都增加。结果表明R363位点替换成His或者Ala都能增加 DBAT的可溶表达，D166位点替换 成Ala可溶表达量减少，替换成His时则增加。
[0113] 分别将这些突变体诱导、表达和纯化(图2)，进行酶学性质测定。
[0114] 实施例4DBAI1酶的酶学性质分析 [0115]( - )动力学参数的测定
[0116] 以10-DAB和乙酰辅酶A为底物，在pH 7.4，0.5mol/L磷酸钠缓冲液中，于30 °C反应 1 h条件下，按照上述酶活力测定方法，测定突变酶在2~1 Ommo 1 /L底物浓度下产物巴卡亭 ΠI的生成量，重复测定3次。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算酶的Km、Vmax和kcat 〇
[0117] (二)突变酶最适反应温度的测定
[0118] 取适量纯化后的突变酶加入到磷酸钠缓冲液(0.5111〇1/1，？!17.4)中，并在不同的 温度(l〇°C~60°C，间隔10°C)条件下，分别设置6个反应体系，测定其最适反应温度，10-DAB 和乙酰辅酶A的浓度均为400ymol/L 10-DAB，参照上述测定其酶活力，重复测定3次。以突变 酶在不同温度条件下所测得的最高酶活力为100%，其它值与之比较得到的相对值作图。 [0119](三)突变酶的最适反应pH的测定
[0120]为了测定突变酶的最适pH值，我们在标准状态下，以1.2M的蔗糖为底物30°C水浴 反应60min后，对蔗糖磷酸化酶水解反应的最适pH进行了摸索。将纯化后的突变酶在不同的 pH(4.0~9.0)条件下进行酶促反应测定其最适pH值，所使用的缓冲液为0.5mol/L醋酸盐缓 冲液4讯4.0~5.0);0.5111〇1/1磷酸钠缓冲液4!1(6.0~8.0) ;0.5111〇1/11^8-!1(：1缓冲液， pH(8.0~9.0)。并参照上述测定其酶活力，重复测定3次。酶活最高的一组反应缓冲液pH值 为该酶的最适pH值设定酶活为100%，以此为标准制作不同pH值与酶相对活性关系曲线。
[0121] 结果与分析：
[0122] (一)突变酶的酶学性质测定
[0123] 利用上述纯化的突变酶，分别以乙酰辅酶A和10-DAB为底物，进行酶学性质测定， 以研究这些理性设计位点是否能如预期效果。
[0124] (1)D166A
[0125] 突变体D166A对pH的影响。看出，该酶最佳反应pH是7,这和野生型DBAT-致。但是， 在酸性范围内，其活力下降较明显，这和野生型又有比较大的差别。如在pH=6时，野生型 DBAT的相对酶活约为70%，而D166A不到50% ;在pH=8时，野生型DBAT的相对酶活和D166A 相当。从酶对环境pH的适应角度来看，Asp属于酸性氨基酸，Ala属于脂肪族氨基酸，Aspl66 位点突变成Ala，不利于保持酶活性，降低了适应性。我们推测Hisl62发生亲核攻击，需要夺 取10-DAB上醇羟基的氢，而在酸性环境下，这一机制极有可能受到干扰，从而使酶活降低。
[0126] 另外，我们考察了D166A的最适温度。表明D166位点突变成Ala，并未对温度适应性 有明显的影响。
[0127] (2)D166H
[0128] 为进一步验证D166位点是否为活性残基H162提供反应的微环境，我们设想，把酸 性氨基酸Asp替换成碱性氨基酸(如His)同样会影响酶对环境pH的适应性。我们继续测定了 D166H的最适PILD166H的最适pH为7,这和野生型DBAT和突变体D166A-致。所不同的是，在 pH=6时，D166H的相对酶活还保留在80%以上，这明显高于野生型DBAT和D166A;而在pH=8 时，0166!1的相对酶活力却下降到了50%左右，这低于野生型0841'和01664。因此，我们认为， D166位点不仅维持了蛋白的高级构象，而且在Hisl62发生亲核攻击的时候，为其提供了一 定的微环境。
[0129] 另外，我们测试了 D166H的最适反应温度。可以看出，其最适温度是30°C，这和野生 型DBAT和D166A-致。但在较低温度下，还能保持较高的酶活，我们猜测，D166突变成His后， 更利于维持其构象。
[0130] (3)R363H
[0131] pH对突变体R363H酶活的影响。看出，R363H表现出的性质和野生型完全不同，该酶 最佳反应pH是3,这和野生型DBAT相差很远。在酸性范围内，R363H的活力较高，而在碱性环 境中，活性完全消失，这和野生型完全不同。
[0132] His的pKa是6.04，属于弱碱性氨基酸。Arg的pKa是12.48，属于碱性氨基酸。在碱性 环境下，Arg363位点突变成His后，不利于His的质子化，从而使得酶活性大大降低。这也说 明除了环境pH对酶活性有影响之外，在酶活性中心附近的氨基酸残基(D166和R363)同样为 His提供了可供其质子化的微环境，这也在一定程度上决定了酶对环境pH的适应性。
[0133] 另外，我们研究了温度对R363H酶活性的影响。可知，R363H的最适温度是30°C，这 和野生型的一致。但在较高温度（如30~50°C)下，R363H还能保持70%以上的酶活性，而野 生型均下降到50 %以下。这表明R363H拥有更高的温度适应性。
[0134] (4)H162AR363H
[0135] 根据Hi s催化的酰基转移原理，我们构建了双突变位点突变体Η16 2AR36 3H，其中， 替换了原有的活性残基Η162Α，同时在R363的位置引入新的拟活性残基His。酶学性质测定， 表明H162AR363H具有活性，即新引入的活性残基可以正常发挥作用。我们进一步研究了 pH 对其酶活的影响。可知，H162AR363H的最适pH为6，而且在酸性环境下（如pH=4~6时