?Cycle Pure Kit纯化， 测定回收浓度后备用。
[0045] 分别在阴性对照和P C R回收产物中，加入D ρ η I限制性内切酶（10 U / μ L，可不加 buffer)，在37°C金属浴中消化lh。利用DNA凝胶电泳检测酶切情况。
[0046](二)测序验证突变酶载体构建成功
[0047]将消化后的PCR产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，涂板培养过夜，挑取拟阳 性克隆子进行测序验证，确定成功获得突变酶表达载体。
[0048](三)获得突变菌株
[0049] 酶切鉴定和测序鉴定后，重组质粒转化E.coli BL21菌株，获得DBAT突变酶的重组 表达菌株。
[0050] 表1获得DBAT突变酶所用到的引物
[0051]
[0052]结果分析：
[0053] (一)活性中心正四面体
[0054] 活性中心是酶催化的核心部位，其特定的构象不仅有助于底物结合，还能促进酶 的高效催化。然而，酶活性中心细微的变化也可能会带来酶的性质很大的变化(甚至影响酶 正常的生物学功能），因此，一般尽可能避免改造活性位点（Schmid，2011)。
[0055] 20世纪初，在对大量不同类型酶在变性过程中的活力、构象变化进行研究，学者们 发现酶的失活往往发生在可检测的蛋白质整体构象变化之前，即酶是先失活，后变性。这表 明，酶活性中心的构象脆弱性可能是导致酶失去活性的根本原因 (Benkovic et al. ,2003; C.-L.Tsou，1998;C.Tsou，1993)。因此，我们认为在不破坏活性中心的构象的前提下，对酶 的适当理性设计，不但可能不会破坏酶的活性，还可能改变酶的活性。
[0056]其中，我们发现，当D166和R363突变成Ala后，酶活均下降；分子对接结果表明， D166和R363均与乙酰辅酶A形成疏水作用。进一步的定点突变实验表明，这两个位点的突变 仍然能保留一部分活力，因此，这种疏水作用并不完全决定整个酶促反应过程能否进行。 [0057] 另外，我们发现，在野生型DBAT中，H162、D166和R363与乙酰辅酶A硫酯键的距离相 当，而且这三个氨基酸残基的距离也相近，构成正四面体结构。我们推测，这两个位点可以 被改造。尤其是DBAT催化乙酰辅酶A的酰基转移是由单个His发起，这些为引入新的催化位 点提供了理论基础。
[0058] (二)D166 位点
[0059] (1)D166A
[0060]我们首先利用同源建模，获得D166A突变体的三维结构。再和乙酰辅酶A为底物进 行分子对接。突变后Alal66和乙酰辅酶A形成作用力，这和Ala属于疏水性氨基酸有关。和野 生型相比，D166A中口袋内的氨基酸，略有变化。推测这和活性下降有关。
[0061] 从距离上看，Hisl62和乙酰辅酶A的S原子的距离为3.8A。这比野生型更近，理论上 讲，这更利于Hisl62发动亲核攻击。而Alal66的距离同样变近，增大了空间位阻效应，推测 这些均和活性下降有关。
[0062] (2)D166H
[0063] 根据野生型DBAT和D166A的对接结果，D166(或A166)位点距离乙酰辅酶A较近，于 是，我们设想，把D166突变成His后，可能会形成两个活性位点，理论上同样有可能参与反 应。
[0064] 首先利用同源建模，获得D166H的三维结构。D166H和WT(野生型DBA!1酶）的骨架的 RMSD值为0.161A,表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化。再和乙酰辅酶A进行分子对 接。突变后Hisl66和乙酰辅酶A形成疏水作用力，这和His属于疏水性氨基酸有关，推测这极 有可能改变原有酶学性质。和野生型相比，D166H中，形成口袋的氨基酸残基数目和种类并 没有较大的改变。
[0065] 从空间距离来看，在D166H中，导致Hisl62和乙酰辅酶A的距离是4.7A。这和野生型 DBAT相比，更近的距离更利于发动攻击。另外，新引入的氨基酸残基Hisl66同样距离乙酰辅 酶A较近，也即是说，乙酰辅酶A的羰基有可能同时受到两个组氨酸的亲核攻击，这可能会导 致酶活的提高。另外，天冬氨酸和组氨酸分别带负电和正点，这意味着酶的最适pH可能会发 生变化。
[0066] (三)R363位点
[0067] (1)R363H
[0068]在野生型DBAT中，R363处于溶剂通道内，和乙酰辅酶A形成疏水作用力。而将其突 变成Ala后，导致酶活下降，表明R363并不决定反应能否进行。我们设想，将其突变成His后， 可能会改变酶学性质。首先进行同源建模，R363H和WT的骨架的RMSD值为0.226人，表明突变 并没有引起蛋白结构的剧烈变化，再和乙酰辅酶A对接，His363同样和乙酰辅酶A形成疏水 作用力。和野生型DBAT相比，口袋内的氨基酸略有变化。另外精氨酸的pKa = 12.5，而组氨酸 的pKa = 6.1，推测突变可能会引起酶的最适pH的变化。
[0069] 进一步考察了 Hisl62和His363到乙酰辅酶A的距离，分别为4.7A和5.0A,这表明， 乙酰辅酶A可同时受到两个His(新引入的His363和原有Hisl62)的攻击，可能会导致酶学性 质的改变。
[0070] (2)H162AR363H
[0071] Hisl62是DBAT的关键残基，将其突变后酶活完全丢失。而His上的咪唑基是发动攻 击的直接参与者。我们猜想，将原有Hisl62突变导致酶活丢失，再将口袋内和乙酰辅酶A的 较近的R363残基突变成His，可能会导致酶活的恢复。
[0072] 同样，首先利用同源建模，构建H162AR363H的三维结构，H162AR363H和WT的骨架的 RMSD值为0.228A,表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化。再和乙酰辅酶A进行对接。新 引入的His363和乙酰辅酶A之间形成作用力，表明这一新活性位点可能会发挥催化作用。而 Aspl62位点虽然被突变成Ala，但新引入的Alal62同样参与和底物的结合过程。
[0073] His363距离乙酰辅酶A的距离为4.5 A，这一距离使得His的咪唑基团能有效接触到 乙酰辅酶A的羰基碳，进一步表明这一位点可能会参与酰基转移过程。
[0074] (3)D166HR363H
[0075] 从乙酰辅酶A和上述各个突变酶的对接结果来看，单个突变并不会对整个蛋白的 三维结构有大的影响，反而这些位点可能是理性改造酶的最佳候选位置。我们设想，在DBAT 的溶剂通道内，同时引入3个His，而且这3个His均距底物的距离足够小，就增加乙酰辅酶A 被任意一个His残基亲核攻击的可能，从而提升酶活。
[0076] 因此，我们利用同源建模构建了 D166HR363H双突变酶，D166HR363H和WT的骨架的 RMSD值为0.249A,表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化。再将其和乙酰辅酶A进行对 接，Hisl62、Hisl66和His363三个氨基酸残基均和乙酰辅酶A形成作用力。
[0077] Hisl62、Hisl66和His363和乙酰辅酶A的距离分别为5 (、A，9.1 A和40A,这均足以 让乙酰辅酶A受到这三个氨基酸残基的亲核攻击。因此，我们认为，理论上来说，D166HR363H 双突变酶的活性同样会增加。
[0078] 实施例3突变酶工程菌株TBL-R363H的发酵验证及酶活分析
[0079](一)工程菌株的发酵、蛋白诱导及纯化 [0080] 1、蛋白诱导表达
[0081 ] 用重组质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得的重组表达菌株TBL21-R363H。按照 1%接种量将阳性克隆菌液接种到l〇〇mL LB液体培养基中（加入100yg/mL的氨苄青霉素）， 37°C，220rpm培养至0D600 = 0.6~0.8左右，加入终浓度为ImM诱导剂IPTG，28°C诱导3h。
[0082] 在4°C，8000rpm离心10min收集菌体，每100mL原始发酵液加入20mL磷酸缓冲液 (PBS，pH 7.4)进行重悬。利用超声细胞破碎仪对重悬菌体进行破碎，总超声时间12min，工 作6 s，间隔6 s，功率4 0 0 W，超声过程中菌液始终保持冰浴。破碎后按4 °C，12 0 0 0 r p m离心 10min，分别收集上清和沉淀。分别对上清和沉淀进行分离胶浓度为8%的SDS-PAGE蛋白质 电泳，检测DBAT突变酶在表达系统E. coliBL21中的表达情况。
[0083] 2、蛋白纯化
[0084] 经过SDS-PAGE检测后，按上一步操作重新诱导蛋白。细胞裂解液替换成（50mM NaH2P04，300mM氯化钠，10mM咪唑，ImM PMSF，pH8.0)。破碎细胞，离心收集上清液。
[0085] 先装好层析柱（lcmXIOcm)，柱材料用量为5~10mg/l mL，用细胞裂解液平衡柱 子。将离心得到的上清酶液上样挂柱，用5倍柱体积的缓冲液A冲洗镍柱以清除非特异结合 的杂蛋白，接适量蛋白流出液并做好标记，分光光度计测定蛋白浓度，同时进行SDS-PAGE检 测杂蛋白的洗脱情况。洗脱完之后用5~10倍柱体积缓冲液B彻底洗脱镇柱，洗脱完之后的 镇柱用5~10倍柱体积的20%乙醇冲洗后置于4°C保存。
[0086]将经过SDS-PAGE蛋白电泳验证的收集管中的蛋白洗脱液合并于超滤管（lOKDa)中 进行4 °C超滤浓缩。当洗脱液浓缩至约lmL左右时加入9mL浓缩缓冲液(20mM酸钠，200mM氯化 钠和10%甘油)继续浓缩，重复两次。最后将酶液浓缩至lmL左右加入甘油至终浓度为20%， 分装于菌种保存管中，置于_80°C保存。
[0087](二)突变酶的酶活分析 [0088] 1、蛋白浓度测定
[0089]采用Bradford法进行蛋白含量的测定。主要原理是当考马斯亮