专利名称：一种用于快速测定蛋白质n端序列的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的测序方法。具体的说，涉及蛋白质N端序列的质谱测定方法。本发明还涉及用于该方法的试剂盒。
背景技术：
众所周知，蛋白质的N端测序对蛋白质的鉴定及功能分析都非常重要。一方面，蛋白质的N端序列标签具有很高的特异性。据统计，43％至83％的蛋白质具有独特的N端4残基标签(依物种而异)[Wilkins，M.R.，Gasteiger，E.，Tonella，L.，Ou，K.et al，J.Mol.Biol.1998，278，599-608.]。另一方面，蛋白质的N端序列有助于确证蛋白质的N端加工，如信号肽的去除、N端蛋氨酸残基的切除等。目前，最常用的测定蛋白质N端序列的方法是Edman降解法。虽然也可以实现自动化，但它对样品的纯度要求很高，很耗时，方法的通量也很低。
本发明提供了一种简单快速、既可进行蛋白质N端测序，又可同时对其它肽段进行分析以鉴定蛋白质的高通量方法。
发明内容
本发明提供了一种简单有效、用于快速测定蛋白质N端序列的新方法和试剂盒。本发明人发现，通过在蛋白质的N端引入带负电荷的磺酸基，既可以在负离子模式质谱中确定N端肽段，又可以在正离子模式质谱中对肽段进行质谱测序。
具体的说，该方法涉及蛋白质氨基的修饰、还原烷基化和胰酶酶切、酶切肽段的质谱分析、N端肽段的质谱识别与测序，步骤包括(1)对蛋白质的侧链氨基进行修饰，以提高修饰反应的选择性和酶切产生的N端肽段的长度；(2)用一种或多种试剂衍生蛋白质的N端氨基，以引入pKa小于2的酸性基团。
(3)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(4)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；(5)用质谱技术确定蛋白质N端肽段，并进行其序列分析。
其特征在于所述步骤(2)的处理方法为(a)用磺酸衍生物对蛋白质的末端氨基进行化学修饰，使其带上酸性基团；(b)用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
其中，步骤(a)所述酸性基团选自2-磺基乙酰基，3-磺基丙酰基，2-磺基苯甲酰基或3-磺基苯甲酰基。
该方法通过在蛋白质的N端引入酸性较强的基团，使其在负离子模式质谱中特别容易离子化而被检测，不需分离而快速确定N端肽段，然后通过质谱技术实现蛋白质的鉴定及N端测序。加在蛋白质N端肽段上的酸性基团特别容易失去质子而带负电荷，因而在负离子模式中非常容易电离而被质谱检测，很容易与蛋白质的其它肽段相区分。在质谱分析中，引入的酸性基团可以促进肽段离子的裂解，简化其二级质谱图，从而有助于其序列分析。
利用本方法，大大提高了蛋白质N端测序的速度和通量化水平，显著增加了N端肽在二级质谱中的裂解效率，使碎片离子的信噪比大大提高，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图对蛋白质末端肽进行从头测序。
本发明还提供了一种用于快速测定蛋白质N端序列的试剂盒，该试剂盒含有(a)一种或多种可对蛋白质N端氨基进行修饰，使其带上酸性基团的试剂；(b)一种或多种含游离氨基的化学试剂；其中组分(a)所述试剂优选具有磺酸基的酰化试剂；组分(b)所述化学试剂优选三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶；侧链氨基保护试剂，如O-甲基异脲；此外还可含有国家行政机关批准的使用说明等。
本发明的新方法和试剂盒适用于蛋白质的鉴定与N端序列的快速测定，适用于生物学、医学、药物学研究和应用领域中蛋白质的鉴定和N端测序，特别适合于基因工程重组产品或药物的N端序列分析及质量控制，与二维电泳技术相结合也适用于对蛋白质进行规模化的N端测序。
本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质研究。
图1.磺化修饰后肌红蛋白的负离子模式肽质量指纹图(基峰为N端肽段)图2.磺化修饰后肌红蛋白N端肽的串联质谱3.磺化修饰后两种来源重组人生长激素的负离子模式肽质量指纹图比较(标*者为N端肽段)图4.磺化修饰后两种来源重组人生长激素的N端肽的串联质谱图比较图5.磺化修饰后鸡溶菌酶的负离子模式肽质量指纹图(基峰为N端肽段)
图6.磺化修饰后鸡溶菌酶N端肽的串联质谱图具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1 马心肌红蛋白的N端测序1.1取0.1mg马心肌红蛋白，溶于0.1mL 0.2M pH 7的硼酸盐溶液，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时后，加入100mM pH 8的Tris/HCl终止反应。肌红蛋白不含半胱氨酸残基，故可省去还原烷基化步骤。加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小时。
1.2质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。将样品与基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL点在样品靶上，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见基峰的质荷比为1998.0，对应于修饰后N端肽的[M-H+]-离子峰(见图1)。然后切换到正离子反射模式下，选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主。例如，1999.9的质谱图中可观察到y3至y16的所有y型离子(见图2)。
实施例2 不同来源的重组人生长激素的N端测序与序列比较2.1取不同来源的两种重组人生长激素样品各0.1mg，分别溶于0.1mL 0.2M pH 7的硼酸盐溶液，各加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时后，加入100mM pH 8的Tris/HCl终止反应。再加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小时。
2.2质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。将样品与基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL点在样品靶上，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见两个样品中基峰的质荷比分别为1243.5和1112.5，对应于各自修饰后N端肽的[M-H+]-离子峰(见图3a和3b中带*标记者)。切换到正离子反射模式下，选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主。将两个样品的质谱图进行比较，很容易发现其N端序列的差异一个仍保留N端的蛋氨酸残基，而另一个则被去除(见图4)。
实施例3 鸡溶菌酶的N端测序3.1取0.1mg鸡溶菌酶，溶于0.1mL 0.2M pH 7的硼酸盐溶液(含0.1％SDS)，加入0.1mL 1M pH 12的O-甲基异脲溶液，37℃反应2小时。调pH至7后，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时，加入100mM pH 8的Tris/HCl终止反应。再加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小时。
3.2质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。将样品与基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL点在样品靶上，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见基峰的质荷比为830.4，对应于修饰后N端肽的[M-H+]-离子峰(见图5)。然后切换到正离子反射模式下，选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主。例如，832.4的质谱图中可观察到y1至y5的所有y型离子(见图6)。
权利要求
1.一种用于快速测定蛋白质N端序列的方法，该方法包括(1)对蛋白质的氨基进行化学修饰(2)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(3)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；(4)用质谱分析技术分析蛋白质末端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；其特征在于所述步骤(1)的处理方法为(a)用磺酸衍生物对蛋白质的末端氨基进行化学修饰，使其带上酸性基团；(b)用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)所述酸性基团选自2-磺基乙酰基，3磺基丙酰基，2-磺基苯甲酰基或3-磺基苯甲酰基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)所述化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
4.一种用于快速测定蛋白质N端序列的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(a)一种或多种可对蛋白质末端氨基进行修饰，使其带上酸性基团的试剂；(b)一种或多种含游离氨基的化学试剂；
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于(a)所述试剂为具有磺酸基的酰化试剂。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于(b)所述化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
全文摘要
为了快速地确证蛋白质，尤其是基因工程重组蛋白质的N端序列，本专利提供了一种用于快速测定蛋白质N端序列的新方法和试剂盒。该方法涉及蛋白质氨基的修饰、还原烷基化和胰酶酶切、酶切肽段的质谱分析、N端肽段的质谱识别与测序。通过对N端氨基的选择性磺化修饰，在质谱上既容易确定N端肽段，又可以很方便地进行测序，主要用于确证蛋白质，尤其是基因工程产品的N端序列。本专利还描述了便于该方法实施的试剂盒。
文档编号G01N30/06GK101042376SQ200610065078
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者钱小红, 周春喜, 张养军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所